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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
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happywoheni

铁虫 (小有名气)

[求助] 【求助】基因克隆T载体酶切问题等

求助啊，本人纯属菜鸟，问题较多，请大家帮帮忙！
1：引物中添加的限制性酶切位点是选择T载体上有的还是没有的？完全不懂！
2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位点，下游引物5’加了EcoR1酶切位点,可以用宝生物的pmD-19 T载体吗？
3：我现在做pcr产物的纯化，想问一下，下一步T载体和pcr产物都要经过双酶切之后，再连接吗？还是T载体可以不用双酶切，只是pcr产物双酶切？还是其他？
4：pcr产物可以直接双酶切吗，酶切缓冲液用哪一种，温度一个是30度一个是37度。
5：如果T载体不用酶切，直接连，酶切鉴定作用是什么？怎么做？用这两种限制性内切酶切吗？切完之后是不是有很多段？
5：蓝白斑筛选操作步骤

在线等，急……
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【分子生物】EPI帖

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1楼2011-07-06 20:12:08
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
dhd997: 换简体中文？ 2011-07-07 07:45:58
閭ｆ槸涓?鏄�?�?㈣浇浣擄紝璐ㄧ矑杞戒綋鐨勮�?�?湁杩欎袱涓叾鍒囦�?鐐瑰氨�?互浜嗭�?
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6楼2011-07-07 07:23:24
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-07-06 21:06:34
happywoheni(金币+1): 2011-07-07 07:17:02
引用回帖:
Originally posted by happywoheni at 2011-07-06 20:12:08:
求助啊，本人纯属菜鸟，问题较多，请大家帮帮忙！
1：引物中添加的限制性酶切位点是选择T载体上有的还是没有的？完全不懂！
2：我做基因克隆，用的上游引物5‘加了BamH1酶切位点，下游引物5’加了EcoR1酶切位点 ...

你用的载体是宝生物的pMD19-T载体吗？如果是的话，载体本身也带有BamHI的酶切位点的，还有你把目的基因连到T载体以后是要测序吗？还是要做什么后续实验啊？反正我之前用这个载体都是直接把目的片段和载体连接的，不用酶切，你可以看看宝生物的说明书的。
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2楼2011-07-06 20:32:25
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happywoheni

铁虫 (小有名气)
是用的宝生物的pMD19-T载体，连接完了要导入到大肠DH5a中。我的意思是我的引物和T载体有相同的两个限制性内切酶，会不会有影响？
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3楼2011-07-06 22:42:45
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 果断EPI 2011-07-06 23:20:43
引物中选择的酶切位点最好是在T载体上没有的，因为T载体连接上外源片段，验证正确之后，要双酶切质粒后跑电泳来回收外源片段。如果载体上有你设定的酶切位点，那么双酶切之后就不是只有载体和外源片段两条带了，但是如果你能保证不干扰你要回收的外源片段，双酶切之后你的外源片段还是能与其它条带分开，那么就没关系。
BamH1和EcoR1都是很常用的酶，一般载体上都有的，依照我上面说过的，只要能保证效果就可以。但是如果两个酶切位点相距太近，第一个酶切了之后第二个酶会结合不上去的。
T载体和PCR产物的连接不用双酶切，因为T-A连接是利用Taq酶在PCR产物3'末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3'末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，所以不用再进行其它酶切就能连接。
pcr产物最好别直接双酶切吗，经过回收之后再双酶切，体系里的其它物质会少一些，但是你的第三个问题解决了，这第四个问题就没有必要回答了。
双酶切验证是不保险的，最好是送测序，因为双酶切只能说明片段大小，不能知道是否有点突变。
蓝白斑筛选的原理见
http://baike.baidu.com/view/961540.htm
http://wenku.baidu.com/view/acb85ffbaef8941ea76e05c5.html
看完了就知道怎么做了。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-07-06 23:09:00
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