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两个基因融合不起来
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现在在做基因的融合表达，把A和B两个基因用overlapPCR的方法融合起来。A B两个基因都用PCR的方法扩出来了，大小与预期的大小一致，并且都是用的保真酶。但overlapPCR就是做不好，两个基因怎么也融合不到一起，都做了好几遍了，我用的是PFU酶，2kb/min,融合基因大概2500bp,是不是酶的问题啊，扩增速度太慢了？ 还有就是我的A基因是直接从基因组中扩增的，B基因是从构建好的PQE载体中扩增的。是不是必须要从构建好的载体中扩增啊？哪位高手指点下啊 |
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西瓜
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【答案】应助回帖
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da_da(金币+2): 2011-06-13 18:35:28
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dhd997(金币+5): good 2011-07-04 18:04:43
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基因从哪里扩增出来的没关系的。 Overlaping PCR的产物一般很少的，条带很淡，你的图最好上来看看。我做的一般上10ul的样，能看到淡淡的条带就ok，有杂带也ok，因为我们还会再拿这个产物作为模板再进行一次扩增。 我印象中Pfu酶的扩增速度比Taq会慢很多，Taq一般是1kb/min，Pfu是600bp/min左右，楼主用的哪家的Pfu酶？2kb/min很快啊。 |
2楼2011-06-12 17:45:06
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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3楼2011-06-12 20:04:47
4楼2011-06-12 20:43:16
5楼2011-06-12 20:45:41
【答案】应助回帖
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da_da(金币+5): 2011-06-13 18:35:40
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dhd997(金币+5): good 2011-07-04 18:05:06
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有的PFU可以到达楼主说的合成效率，我就用过这样的酶 不过他的活性比Taq要差，楼主扩增2.5Kb的目的带有点长，鉴于这种情况：建议楼主将A片段放到某个平端克隆载体（你是用PFU扩增的吧）上，再用A/B两个克隆载体做模板，这样就会非常容易；另外扩增的时候，模板量不能过多，大概30ng/50ul比例就够了（不知道你两个载体的大小，具体情况还需调整）；如果效果还不理想，在上面的基础上在降低退火温度3度左右，延长延伸时间到3min。 Bless you！ |
6楼2011-06-12 21:42:43
空谷幽风
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7楼2011-06-13 15:28:11
8楼2011-06-13 18:21:57
9楼2011-06-13 18:24:44
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我的A B两个片段都是用Pfu扩增的，每次做的都是20倍稀释，然后再做的OverlapPCR，酶的效率是2min/kb我上面写错了。我的PCR体系如下 组成成分 体积（µL） 10×Pfu Buffer with MgSO4 5 dNTP（2.5mM） 5 上游引物（10µM） 2 下游引物（10µM） 2 模板A(回收产物20倍稀释) 1 模板B(回收产物20倍稀释) 1 Pfu DNA Polymerase（1.25-2.5u/µL）1 灭菌去离子水 33 反应总体积 50 PCR反应程序为: 95 ℃预变性5 min ;95 ℃ 30 s ,58 ℃30 s ,72 ℃ 5min10 ,30个循环;72 ℃延伸10 min ;4 ℃60min 。 帮忙看看吧 真的挺着急的 谢谢！！！ |
10楼2011-06-13 18:31:31
40