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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两个基因融合不起来
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da_da

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cellline at 2011-06-12 21:42:43:
有的PFU可以到达楼主说的合成效率，我就用过这样的酶
不过他的活性比Taq要差，楼主扩增2.5Kb的目的带有点长，鉴于这种情况：建议楼主将A片段放到某个平端克隆载体（你是用PFU扩增的吧）上，再用A/B两个克隆载体做 ...

为什么要降低退火温度啊
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心有多大，江湖就有多大！
11楼2011-06-13 18:34:41
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
1、建议你将已获得的A、B片段全部克隆到平端的克隆载体上，这样你直接用二者的菌液做模板进行OverlapPCR；用的时候，50ul的体系各加1ul就可以，或者做25ul体系试试（有的时候，25ul体系能成，50ul就不成，我也纳闷，呵呵）
2、PFU酶的效率有达到2kb/min的，延伸时间段可以一定程度上降低错配
3、dNTP买10mM的，highpure！！！这是PCR底物，纯度高对你的PCR产物好
4、退火温度低，酶的扩增效率就会强些，有助于PCR产物的丰度，不过这样也会增加PCR的非特异性，还是需要你自己摸索，找一个比较适应的温度，你的退火温度58℃，虽说不是很高，但可以稍微降降，如若不放心，可以做一个温度梯度，条件允许的话，在一台pcr仪上就可以搞定。
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12楼2011-06-13 20:50:59
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mengchun

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-04 18:05:35
两个建议：
1.第一轮PCR产物直接用1微升，不要稀释。
2.OVerlap反应条件我常用的参数是：
95 ℃预变性5 min ;95 ℃ 30 s ,50 ℃ 60 s ,72 ℃ 5min ,

然后;95 ℃ 30 s ,55℃30 s ,72 ℃ 5min10 ,30个循环;72 ℃延伸10 min ;16 ℃60min 。
你仔细看看和你的区别，第一步我们实验室称之为overlap必胜的法宝。
祝你好运
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茫茫未知的旅途，我要认真面对我的人生。
13楼2011-07-04 15:01:09
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shujunru

铜虫 (初入文坛)
1、融合PCR还是要看你overlap区域的大小来决定退火的温度；
2、不要稀释第一步PCR的样品
3、两个PCR产物的摩尔量要基本一致
4、适当延长退火和延伸的时间、循环数
5、一定要确定第一步反应条带完全正确，最好测一下序，有时候大小对并不意味着就是你想要的，没有杂带液未必就是你要的目的条带。
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14楼2012-12-12 14:28:49
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