应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两个基因融合不起来
142/2返回列表上一页12
查看: 3106  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

da_da

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cellline at 2011-06-12 21:42:43:
有的PFU可以到达楼主说的合成效率，我就用过这样的酶
不过他的活性比Taq要差，楼主扩增2.5Kb的目的带有点长，鉴于这种情况：建议楼主将A片段放到某个平端克隆载体（你是用PFU扩增的吧）上，再用A/B两个克隆载体做 ...

为什么要降低退火温度啊
赞一下 回复此楼
心有多大，江湖就有多大！
11楼2011-06-13 18:34:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
1、建议你将已获得的A、B片段全部克隆到平端的克隆载体上，这样你直接用二者的菌液做模板进行OverlapPCR；用的时候，50ul的体系各加1ul就可以，或者做25ul体系试试（有的时候，25ul体系能成，50ul就不成，我也纳闷，呵呵）
2、PFU酶的效率有达到2kb/min的，延伸时间段可以一定程度上降低错配
3、dNTP买10mM的，highpure！！！这是PCR底物，纯度高对你的PCR产物好
4、退火温度低，酶的扩增效率就会强些，有助于PCR产物的丰度，不过这样也会增加PCR的非特异性，还是需要你自己摸索，找一个比较适应的温度，你的退火温度58℃，虽说不是很高，但可以稍微降降，如若不放心，可以做一个温度梯度，条件允许的话，在一台pcr仪上就可以搞定。
赞一下(1人) 回复此楼
12楼2011-06-13 20:50:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mengchun

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-04 18:05:35
两个建议：
1.第一轮PCR产物直接用1微升，不要稀释。
2.OVerlap反应条件我常用的参数是：
95 ℃预变性5 min ;95 ℃ 30 s ,50 ℃ 60 s ,72 ℃ 5min ,

然后;95 ℃ 30 s ,55℃30 s ,72 ℃ 5min10 ,30个循环;72 ℃延伸10 min ;16 ℃60min 。
你仔细看看和你的区别，第一步我们实验室称之为overlap必胜的法宝。
祝你好运
赞一下(1人) 回复此楼
茫茫未知的旅途，我要认真面对我的人生。
13楼2011-07-04 15:01:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shujunru

铜虫 (初入文坛)
1、融合PCR还是要看你overlap区域的大小来决定退火的温度；
2、不要稀释第一步PCR的样品
3、两个PCR产物的摩尔量要基本一致
4、适当延长退火和延伸的时间、循环数
5、一定要确定第一步反应条带完全正确，最好测一下序，有时候大小对并不意味着就是你想要的，没有杂带液未必就是你要的目的条带。
赞一下 回复此楼
14楼2012-12-12 14:28:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 da_da 的主题更新
142/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +4 tianxiaoxian 2026-09-28 7/350 2026-09-30 08:34 by 88817753
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-29 19:27 by cqwQDCxMcL3I
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:47 by yCO1Ll7aHtsw
[博后之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:30 by etmYJ6d2rquH
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 4/200 2026-09-29 15:15 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 15:04 by etmYJ6d2rquH
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:58 by etmYJ6d2rquH
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:41 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:30 by etmYJ6d2rquH
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:13 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 7/350 2026-09-29 14:07 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-29 13:56 by etmYJ6d2rquH
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 09:59 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:12 by b8fCuTHqckEt
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-28 19:08 by 9lS3ad5oOymn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭