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da_da

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by cellline at 2011-06-12 21:42:43:
有的PFU可以到达楼主说的合成效率,我就用过这样的酶
不过他的活性比Taq要差,楼主扩增2.5Kb的目的带有点长,鉴于这种情况:建议楼主将A片段放到某个平端克隆载体(你是用PFU扩增的吧)上,再用A/B两个克隆载体做 ...

为什么要降低退火温度啊
心有多大,江湖就有多大!
11楼2011-06-13 18:34:41
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
1、建议你将已获得的A、B片段全部克隆到平端的克隆载体上,这样你直接用二者的菌液做模板进行OverlapPCR;用的时候,50ul的体系各加1ul就可以,或者做25ul体系试试(有的时候,25ul体系能成,50ul就不成,我也纳闷,呵呵)
2、PFU酶的效率有达到2kb/min的,延伸时间段可以一定程度上降低错配
3、dNTP买10mM的,highpure!!!这是PCR底物,纯度高对你的PCR产物好
4、退火温度低,酶的扩增效率就会强些,有助于PCR产物的丰度,不过这样也会增加PCR的非特异性,还是需要你自己摸索,找一个比较适应的温度,你的退火温度58℃,虽说不是很高,但可以稍微降降,如若不放心,可以做一个温度梯度,条件允许的话,在一台pcr仪上就可以搞定。
12楼2011-06-13 20:50:59
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mengchun

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-04 18:05:35
两个建议:
1.第一轮PCR产物直接用1微升,不要稀释。
2.OVerlap反应条件我常用的参数是:
95 ℃预变性5 min ;95 ℃ 30 s ,50 ℃ 60 s ,72 ℃ 5min ,

然后;95 ℃ 30 s ,55℃30 s ,72 ℃ 5min10 ,30个循环;72 ℃延伸10 min ;16 ℃60min 。
你仔细看看和你的区别,第一步我们实验室称之为overlap必胜的法宝。
祝你好运
茫茫未知的旅途,我要认真面对我的人生。
13楼2011-07-04 15:01:09
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shujunru

铜虫 (初入文坛)

1、融合PCR还是要看你overlap区域的大小来决定退火的温度;
2、不要稀释第一步PCR的样品
3、两个PCR产物的摩尔量要基本一致
4、适当延长退火和延伸的时间、循环数
5、一定要确定第一步反应条带完全正确,最好测一下序,有时候大小对并不意味着就是你想要的,没有杂带液未必就是你要的目的条带。
14楼2012-12-12 14:28:49
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