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[求助]
两个基因融合不起来
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现在在做基因的融合表达，把A和B两个基因用overlapPCR的方法融合起来。A B两个基因都用PCR的方法扩出来了，大小与预期的大小一致，并且都是用的保真酶。但overlapPCR就是做不好，两个基因怎么也融合不到一起，都做了好几遍了，我用的是PFU酶，2kb/min,融合基因大概2500bp,是不是酶的问题啊，扩增速度太慢了？ 还有就是我的A基因是直接从基因组中扩增的，B基因是从构建好的PQE载体中扩增的。是不是必须要从构建好的载体中扩增啊？哪位高手指点下啊 |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
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1、建议你将已获得的A、B片段全部克隆到平端的克隆载体上，这样你直接用二者的菌液做模板进行OverlapPCR；用的时候，50ul的体系各加1ul就可以，或者做25ul体系试试（有的时候，25ul体系能成，50ul就不成，我也纳闷，呵呵） 2、PFU酶的效率有达到2kb/min的，延伸时间段可以一定程度上降低错配 3、dNTP买10mM的，highpure！！！这是PCR底物，纯度高对你的PCR产物好 4、退火温度低，酶的扩增效率就会强些，有助于PCR产物的丰度，不过这样也会增加PCR的非特异性，还是需要你自己摸索，找一个比较适应的温度，你的退火温度58℃，虽说不是很高，但可以稍微降降，如若不放心，可以做一个温度梯度，条件允许的话，在一台pcr仪上就可以搞定。 |
12楼2011-06-13 20:50:59
西瓜
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
da_da(金币+2): 2011-06-13 18:35:28
da_da(金币+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金币+5): good 2011-07-04 18:04:43
da_da(金币+2): 2011-06-13 18:35:28
da_da(金币+1): 2011-06-15 10:06:41
dhd997(金币+5): good 2011-07-04 18:04:43
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基因从哪里扩增出来的没关系的。 Overlaping PCR的产物一般很少的，条带很淡，你的图最好上来看看。我做的一般上10ul的样，能看到淡淡的条带就ok，有杂带也ok，因为我们还会再拿这个产物作为模板再进行一次扩增。 我印象中Pfu酶的扩增速度比Taq会慢很多，Taq一般是1kb/min，Pfu是600bp/min左右，楼主用的哪家的Pfu酶？2kb/min很快啊。 |
2楼2011-06-12 17:45:06
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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3楼2011-06-12 20:04:47
4楼2011-06-12 20:43:16