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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-06-13 21:04:30
da_da(金币+3): 2011-06-14 09:14:35
1、建议你将已获得的A、B片段全部克隆到平端的克隆载体上,这样你直接用二者的菌液做模板进行OverlapPCR;用的时候,50ul的体系各加1ul就可以,或者做25ul体系试试(有的时候,25ul体系能成,50ul就不成,我也纳闷,呵呵)
2、PFU酶的效率有达到2kb/min的,延伸时间段可以一定程度上降低错配
3、dNTP买10mM的,highpure!!!这是PCR底物,纯度高对你的PCR产物好
4、退火温度低,酶的扩增效率就会强些,有助于PCR产物的丰度,不过这样也会增加PCR的非特异性,还是需要你自己摸索,找一个比较适应的温度,你的退火温度58℃,虽说不是很高,但可以稍微降降,如若不放心,可以做一个温度梯度,条件允许的话,在一台pcr仪上就可以搞定。
12楼2011-06-13 20:50:59
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