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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于RNA以及cDNA电泳问题，拜求各位大侠指点
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mmojf

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNA以及cDNA电泳问题，拜求各位大侠指点

虾米我实验的目的是先提取RNA，然后将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行

PCR以获取目的片段。实验材料为细菌，提取RNA 后进行紫外分光进行检测浓度，

浓度比较高，260与280的OD比值也符合实验要求。但是反转录后进行PCR无条

带，高手指点后对RNA进行电泳，电泳无条带，同时Marker有条带，证明是可能是

RNA问题，个人总结认为是RNA发生降解，但不知道其降解过程发生在电泳过程中

还是保存过程中，提RNA完全按照说明书进行，而且不明白RNA浓度高但电泳无条

带的原理，就是浓度与完整性的关系。另外，如果出现这样的问题，应该如何避

免，虾米还应该如何操作？另附RNA和cDNA电泳图两张，请大侠指教！我的全部身

家就两个金币了……全都给你了……虽然不多……


PS:问题基本如下 1 电泳无条带原因
                            2 RNA浓度与其完整性关系
                             3 出现问题，如何解决
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1楼2011-06-09 22:13:17
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+6, EPI+1): 2011-06-10 12:22:39
我也深受这个问题困扰。后来我做了一系列降解实验（故意在一些环节出问题，看RNA提取情况）。
相信我，过程都是平行重复3次。有空我会把整个实验发出来。
这里直接说结果吧：
1.RNA几乎不会在电泳过程中降解，无论是放了很久的胶，还是很久没换水的电泳液。
2.OD比值只能大概参考。因为，260和280不知有RNA会吸收，还有很多其他物质。最后这个比值可能是许多原因综合的结果。
3.就是RNA部分降解也能反转，PCR验证基本也没问题。

另外，你的图没发上。具体情况没发分析。
总之我的建议：
1.RNA提取的要点是选对方法，什么组织用什么方法（网上一堆方法，也有很多kit卖）。方法对了肯定能提出来，最多操作不好有部分降解。
2.操作嘛尽量快。
3.反转录的管子干净，很多降解发生在反转录过程。但我的实验从没出现过。
4.所有实验重复3次。是否3次都提不出来？3次都反转没结果？ 有重复性的失败才有讨论价值。
5.最后，RNA提取真的只是个非常小而简单的实验，试剂是最重要的，不是怕污染而是怕过期！我用自来水溶RNA一样条带完整（我当时也被雷到）。
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3楼2011-06-09 22:44:21
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

图捏，OD值是多少，你跑RNA点用的时候用的什么loading，什么枪头，电泳液换了没。虽然RNA很坚强，但是碰到RNAse A还是极端的脆弱，不会是在跑的时候全降解了吧，以经验来说是不会的，除非你真的什么都没有提取出来。看一下图，应该会更好点
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2楼2011-06-09 22:35:28
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mmojf

新虫 (初入文坛)
前两个都是RNA，第三个是cDNA，昨天没有成功上传图片，不好意思了！
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4楼2011-06-10 22:39:41
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mmojf

新虫 (初入文坛)
我不会直接传图上来……丢人
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5楼2011-06-10 22:41:32
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mmojf

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-09 22:35:28:
图捏，OD值是多少，你跑RNA点用的时候用的什么loading，什么枪头，电泳液换了没。虽然RNA很坚强，但是碰到RNAse A还是极端的脆弱，不会是在跑的时候全降解了吧，以经验来说是不会的，除非你真的什么都没有提取出来 ...

你好，谢谢你的回复，图片我没发成功，OD值均在1.50--1.69之间；跑RNA时5倍Buffer 和6 倍Buffer都用过，均无条带；枪头是进口无RNA酶枪头；电泳液使用过老电泳液和新电泳液，但均无条带。
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6楼2011-06-10 22:45:39
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mmojf

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-06-09 22:44:21:
我也深受这个问题困扰。后来我做了一系列降解实验（故意在一些环节出问题，看RNA提取情况）。
相信我，过程都是平行重复3次。有空我会把整个实验发出来。
这里直接说结果吧：
1.RNA几乎不会在电泳过程中降解， ...

你好，谢谢你的回答，提取RNA的试剂都是新的并经过DEPC处理过，实验器材也是；由于提取材料为细菌，按照悬浮细胞进行的操作，不知道是不是在这里出问题；另外RNA提取了3次，反转录两次，均无结果，不知道是否有分析价值；反转录管子可确保干净，但是操作过程有点慢，而且实验室温度有点高，这个是否也会影响结果？另外，五体投地的佩服你的自来水！！真的！
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7楼2011-06-10 22:53:24
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
mmojf(金币+2): 其实不会说什么的，谢谢你啦，这倒是真的。 2011-06-11 21:29:26
lstt09nk(金币+6): 很热心 2011-06-12 19:03:12
引用回帖:
Originally posted by mmojf at 2011-06-10 22:53:24:
你好，谢谢你的回答，提取RNA的试剂都是新的并经过DEPC处理过，实验器材也是；由于提取材料为细菌，按照悬浮细胞进行的操作，不知道是不是在这里出问题；另外RNA提取了3次，反转录两次，均无结果，不知道是否有 ...

只要是实验室的成熟技术那就肯定没问题。以前实验室是否也是用这个方法提取细菌的RNA？如果是，那应该是试剂的问题（有没有过期？RNAse污染问题不大）。手法应该不会出错。
如果是自己摸索的，那尝试换一个新方法。我包括我们实验室碰到过的RNA总是提取不出来都是因为方法不对。比方说组织生长的不同阶段，一些代谢产物含量会变化，而一些成分恰是影响RNA提取的因素。

因此，我的建议，保证材料没问题的前提。换几种方法试试，基本也就提取液不同。可能比你一直摸条件找原因节约时间。个人认为在这种实验上浪费时间很不划算。还不如请实验室某人吃个饭，让他帮你提一次看看。

祝好运，有时候实验就是这样，近水楼台，空见月！
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8楼2011-06-11 21:13:52
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cfynocry
9楼2012-04-11 23:08:34
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soffy0214

铜虫 (小有名气)
我马上也要做了，提前准备！
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上帝关上一扇门，就会打开一扇窗。
10楼2012-07-02 14:28:44
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