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wangchunling

金虫 (小有名气)

[求助] pmd18-t连不上

最近在做一个基因的克隆，载体是pmd18t，菌液pcr之后电泳，总是连不上，怎么回事儿呢？按照说明书做的……
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1楼 2011-05-19 10:08:53
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-19 12:47:32
wangchunling(金币+3): 2011-05-20 09:52:27
wangchunling(金币+2): 2011-05-21 08:31:48
引用回帖:
Originally posted by wangchunling at 2011-05-19 10:08:53:
最近在做一个基因的克隆，载体是pmd18t，菌液pcr之后电泳，总是连不上，怎么回事儿呢？按照说明书做的……

pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
供参考，我以前做的，木问题的。保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。
  附上连接后的图片供参考~
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2楼2011-05-19 10:38:24
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wangchunling

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by beautybanana at 2011-05-19 10:38:24:
pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（ ...

太感谢鸟！
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3楼2011-05-19 13:30:40
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jyfxmc

新虫 (小有名气)
左侧的是marker吗，能说一下你的条带是多少吗？
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4楼2014-03-28 17:01:23
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