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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-19 12:47:32
wangchunling(金币+3): 2011-05-20 09:52:27
wangchunling(金币+2): 2011-05-21 08:31:48
引用回帖:
Originally posted by wangchunling at 2011-05-19 10:08:53:
最近在做一个基因的克隆,载体是pmd18t,菌液pcr之后电泳,总是连不上,怎么回事儿呢?按照说明书做的……

pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                        1uL
DNA template        4uL
Solution I                        5uL
Total                        10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组,16℃保温3~4h后,全量(10uL)转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中,冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后,立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基,37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板, 37℃ 培养16-24h。
供参考,我以前做的,木问题的。保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。
  附上连接后的图片供参考~

2楼2011-05-19 10:38:24
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