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beautybanana

木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-19 12:47:32
wangchunling(金币+3): 2011-05-20 09:52:27
wangchunling(金币+2): 2011-05-21 08:31:48

引用回帖:

Originally posted by wangchunling at 2011-05-19 10:08:53:
最近在做一个基因的克隆，载体是pmd18t，菌液pcr之后电泳，总是连不上，怎么回事儿呢？按照说明书做的……

pMD18-T vector ligation system
pMD18-T                   1uL
DNA template 4uL
Solution I                   5uL
Total                   10uL
将纯化的PCR产物与T载体连接重组，16℃保温3～4h后，全量（10uL）转化至150uL的E.coli DH5α的感受态细胞。
(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。
(4) 吸100μL菌液涂布含Amp/ X-Gal/ IPTG平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
供参考，我以前做的，木问题的。保证PCR产物或感受态细胞的质量即可。
  附上连接后的图片供参考~

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2楼2011-05-19 10:38:24

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