应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 转基因植株DNA PCR检测要不就不出带，要不就连水和阴性对照都出带？？？急急急！！！
51/1返回列表
查看: 3604  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

seamuse

木虫 (著名写手)

[求助] 转基因植株DNA PCR检测要不就不出带，要不就连水和阴性对照都出带？？？急急急！！！

我最近在检测转基因植株T1和T4代DNA,用CTAB法小提的，DNA原液的浓度是3000ng/ul左右，（见附件）稀释20倍后取2微升做的模板，引物1（有师姐已经用过了，效果还挺好的）扩增的片段大小在950bp左右，25微升体系如下
buffer 2.5，
dntp 2,
引物各1微升，
taq酶（5U）0.2微升
模板 2 微升
水 16.3
扩增程序如下95 5min ,94 50s,56 40s,72 90s,35循环，72,10min.
但是扩增结果总是不好，开始是只有很少的几个样出带，（应该大部分都是阳性植株才对，因为上一代都是检测过的，）其中也包括阳性的质粒对照，见图1，
我以为是引物合成不好，就重新合成了但是结果还是不好，后来又设计了几对引物但结果还是不好，要不就是连水和转基因母本（阴性对照）都出带，要不就是还是和之前一样都不出带，从第2张图开始就是另外的引物跑的了，只要出带的都在目的带的大小左右
图1
上面的一排都没出带，就只有下排3个出带的，最后一个是阳性对照


图2
水也出带了，是什么原因啊，换了水和引物后又都不出带了，而且本来同样的体系这一次水没带，下一次又有了

图3也是同样的情况，水和阴性对照（bfck）都出带了

图4pcr，有类似于弥散的现象，还有的就是最下面很亮类似于引物二聚体，像彗星似的带，这张的图放反了，MAKER也表示反了

图5，前面的都有带，但很模糊，后面的都没有了而且拖尾现象严重，


[ Last edited by seamuse on 2011-5-18 at 18:14 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
When you want success as badly as you wanted air, you will get it.----------------------一个人只有当他把追求真理当作一种内在的需要时，才算是真正的...
1楼 2011-05-18 17:51:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seamuse

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-22 23:46:57:
不值楼主基因组是什么基因组？哪种植物的？有些植物基因组过大，很不容易扩增出条带。另外，楼主可以做几个梯度试试，因为不同的人手法不同，比如，别人用56℃的退火温度就能扩的很好，而自己就不一定可以，所以最 ...

我做的是小麦的，梯度也做过了，刚开始没有污染时，做个梯度，有几个退火温度都做过，但就出几条带，后来污染后就是不管多少度都很容易出带了
赞一下 回复此楼
When you want success as badly as you wanted air, you will get it.----------------------一个人只有当他把追求真理当作一种内在的需要时，才算是真正的...
9楼2011-05-24 15:41:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

seamuse

木虫 (著名写手)
求回复啊，万分感谢！
赞一下 回复此楼
When you want success as badly as you wanted air, you will get it.----------------------一个人只有当他把追求真理当作一种内在的需要时，才算是真正的...
2楼2011-05-18 19:09:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谁伴我闯荡

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-05-19 12:46:11
seamuse(金币+5): 非常感谢你的建议！！ 2011-05-19 13:12:05
首先排除模板污染，另外就是避免上样过程中样品漂移。只用双蒸水做一次P，看结果如何；
再找一些未转基因的样品，进行PCR，避免基因组出现错配导致的假阳性；
不出带的和弥散的，估计是引物的问题。可以考虑调整一下退火温度，检查一下引物的匹配度。
我能想到的就这些，祝楼主好运~！
赞一下(1人) 回复此楼
此生愿为扑火蛾，纵是焚化亦无悔
3楼2011-05-19 09:19:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

seamuse

木虫 (著名写手)
恩，谢谢，发现有水和阴性对照污染后，我就又用无菌水重新稀释的新的引物，跑了下发现水没带了，但是今天又换了对引物后（也是用灭过菌的水稀释的）水又有带了，哎，我是真郁闷了。关于退火温度，我做过梯度的，没多大用处，不太稳定！
赞一下 回复此楼
When you want success as badly as you wanted air, you will get it.----------------------一个人只有当他把追求真理当作一种内在的需要时，才算是真正的...
4楼2011-05-19 18:39:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 293求调剂 +9 zjl的号 2026-03-16 14/700 2026-03-18 05:13 by qytt腾飞
[考研] 344求调剂 +4 knight344 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:27 by ruiyingmiao
[考研] 化学工程321分求调剂 +11 大米饭！ 2026-03-15 14/700 2026-03-17 17:11 by ruiyingmiao
[考研] 271求调剂 +12 生如夏花… 2026-03-11 14/700 2026-03-17 10:56 by lovewei0727
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 311求调剂 +5 26研0 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:21 by a不易
[考研] 0703一志愿211 285分求调剂 +5 ly3471z 2026-03-13 5/250 2026-03-16 16:16 by 哦哦123
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +6 RuitingC 2026-03-12 6/300 2026-03-16 14:50 by 可淡不可忘
[考研] 求老师收留调剂 +4 jiang姜66 2026-03-14 5/250 2026-03-15 20:11 by Winj1e
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +6 Mochaaaa 2026-03-12 7/350 2026-03-13 22:18 by 星空星月
[考研] 工科，求调剂 +3 我887 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:39 by JourneyLucky
[考研] 333求调剂 +3 球球古力 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:27 by JourneyLucky
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +7 ADT 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:17 by JourneyLucky
[考研] 0817化学工程与技术考研312分调剂 +3 T123 tt 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:49 by houyaoxu
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考博] 26读博 +4 Rui135246 2026-03-12 10/500 2026-03-13 07:15 by gaobiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭