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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 双酶切切不开
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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切切不开

求助：最近构建重组质粒，用到双酶切，两个限制性酶分别是EcoR I和EcoR v（只有这两个酶可以用），酶切总是切不开，蓝白斑筛选时全是蓝斑，而且这两个酶切位点在我的质粒上是毗邻的。想问一下，这种一个粘性末端酶和一个平末端酶，酶切应该怎么做？
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
1楼 2011-05-13 15:55:50
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小皮球邓

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-14 21:58:04
你可以一个酶少加点，时间要充足。
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坚持就是胜利！
2楼2011-05-13 18:43:03
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C-JingX

金虫 (小有名气)
时间是很充足的，而且酶的量很少，才1ul，做过很多次，两个酶同时切，一个一个切都试过，但都不行。
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
3楼2011-05-13 20:29:54
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
scelab(金币+3): 谢谢交流 2011-05-14 10:10:44
C-JingX(金币+2): 谢谢 2011-05-14 18:32:10
首先我们分析一下，是切不开还是连不上
1.由于这两个酶切微点毗邻，你拿载体另外一个位置上的酶切位点分别和它们这两个做双酶切，鉴定一下这两个酶切位点能否切开。（电泳检测）
2.理论上，一个平末端和一个粘末端是很好连接的。实在担心，你可以酶切后去磷酸化处理一下
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2011-05-14 01:10:48
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
楼主说“两个酶同时切，一个一个切都试过，但都不行”，看来是切不动质粒。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-05-14 03:56:24
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
scelab(金币+2): 谢谢交流 2011-05-14 10:11:07
C-JingX(金币+2): 谢谢！ 2011-05-14 18:37:19
你要做的连接方向很关键吗？如果不是，直接该做EcoRI单酶切再连接，换一下片段酶切位点就行了，如果很关键，还是这样做，然后挑几个白斑测序选出你要的方向即可！
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6楼2011-05-14 05:49:33
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-14 03:56:24:
楼主说“两个酶同时切，一个一个切都试过，但都不行”，看来是切不动质粒。

要是片段酶切开呢？
你质粒切得再开也是枉然，我之所以再引入一个酶切位点（当然这个在载体上的位置要合适，便于电泳检测么，且要好用），只是想证明一下质粒上的两个酶切位点到底有木有问题。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2011-05-14 10:47:57
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+2): 谢谢 2011-05-14 18:41:22
C-JingX(金币+4): 2011-07-08 21:18:37
质粒上的位点不大会有问题的，酶切的问题更有可能。是什么质粒，毗邻到底是隔了多少个碱基，能不能用相隔远一点的位点？重新设计一对引物。只有这两个酶可以用是什么意思？

我还是想问，切不开是什么意思，切的是载体还是质粒，依据什么实验结果来判断切不开？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2011-05-14 17:18:35
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C-JingX

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-05-14 01:10:48:
首先我们分析一下，是切不开还是连不上
1.由于这两个酶切微点毗邻，你拿载体另外一个位置上的酶切位点分别和它们这两个做双酶切，鉴定一下这两个酶切位点能否切开。（电泳检测）
2.理论上，一个平末端和一个粘末 ...

我做过很多中方法：1、PCR后与T载体连接，转JM109，几乎全是蓝斑，好不容易有个阳性，提取质粒，酶切，但切不开。
2、直接将我的目的基因和要连接的质粒进行双酶切后转DH5a，PCR检测发现全为假阳性。因为酶切后没有立即检测，所以不知道是否切开，也进行过分步酶切。
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
9楼2011-05-14 18:36:36
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C-JingX

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yguang at 2011-05-14 05:49:33:
你要做的连接方向很关键吗？如果不是，直接该做EcoRI单酶切再连接，换一下片段酶切位点就行了，如果很关键，还是这样做，然后挑几个白斑测序选出你要的方向即可！

很关键，我也想做单酶切，呵呵，就是觉得切了以后还要辨认方向，辨认方向会不会很难？
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
10楼2011-05-14 18:38:30
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