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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 双酶切切不开
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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切切不开

求助：最近构建重组质粒，用到双酶切，两个限制性酶分别是EcoR I和EcoR v（只有这两个酶可以用），酶切总是切不开，蓝白斑筛选时全是蓝斑，而且这两个酶切位点在我的质粒上是毗邻的。想问一下，这种一个粘性末端酶和一个平末端酶，酶切应该怎么做？
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1楼 2011-05-13 15:55:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
楼主说“两个酶同时切，一个一个切都试过，但都不行”，看来是切不动质粒。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-05-14 03:56:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+2): 谢谢 2011-05-14 18:41:22
C-JingX(金币+4): 2011-07-08 21:18:37
质粒上的位点不大会有问题的，酶切的问题更有可能。是什么质粒，毗邻到底是隔了多少个碱基，能不能用相隔远一点的位点？重新设计一对引物。只有这两个酶可以用是什么意思？

我还是想问，切不开是什么意思，切的是载体还是质粒，依据什么实验结果来判断切不开？
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8楼2011-05-14 17:18:35
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-14 21:59:02
两个酶切位点之间没有任何碱基，说不定一个酶能切，另一个酶就结合不上去了，可否用别的酶，常用的有二十多种酶，你的序列上不会全都有的，没有的酶就买，只要能买。

如果你想要构建质粒，那就把别的质粒的多克隆位点引入你现在用的质粒，大概一周就行了。

另外我觉得奇怪，你非要用这个质粒不可？你是怎么选择这个质粒的？有没有想过候选的质粒？
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14楼2011-05-14 20:00:13
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