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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切切不开

求助:最近构建重组质粒,用到双酶切,两个限制性酶分别是EcoR I和EcoR v(只有这两个酶可以用),酶切总是切不开,蓝白斑筛选时全是蓝斑,而且这两个酶切位点在我的质粒上是毗邻的。想问一下,这种一个粘性末端酶和一个平末端酶,酶切应该怎么做?
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走自己的路,不要追逐别人的脚步!
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小皮球邓

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-05-14 21:58:04
你可以一个酶少加点,时间要充足。
坚持就是胜利!
2楼2011-05-13 18:43:03
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C-JingX

金虫 (小有名气)

时间是很充足的,而且酶的量很少,才1ul,做过很多次,两个酶同时切,一个一个切都试过,但都不行。
走自己的路,不要追逐别人的脚步!
3楼2011-05-13 20:29:54
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
scelab(金币+3): 谢谢交流 2011-05-14 10:10:44
C-JingX(金币+2): 谢谢 2011-05-14 18:32:10
首先我们分析一下,是切不开还是连不上
1.由于这两个酶切微点毗邻,你拿载体另外一个位置上的酶切位点分别和它们这两个做双酶切,鉴定一下这两个酶切位点能否切开。(电泳检测)
2.理论上,一个平末端和一个粘末端是很好连接的。实在担心,你可以酶切后去磷酸化处理一下
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2011-05-14 01:10:48
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

楼主说“两个酶同时切,一个一个切都试过,但都不行”,看来是切不动质粒。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-05-14 03:56:24
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
scelab(金币+2): 谢谢交流 2011-05-14 10:11:07
C-JingX(金币+2): 谢谢! 2011-05-14 18:37:19
你要做的连接方向很关键吗?如果不是,直接该做EcoRI单酶切再连接,换一下片段酶切位点就行了,如果很关键,还是这样做,然后挑几个白斑测序选出你要的方向即可!
6楼2011-05-14 05:49:33
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-14 03:56:24:
楼主说“两个酶同时切,一个一个切都试过,但都不行”,看来是切不动质粒。

要是片段酶切开呢?
你质粒切得再开也是枉然,我之所以再引入一个酶切位点(当然这个在载体上的位置要合适,便于电泳检测么,且要好用),只是想证明一下质粒上的两个酶切位点到底有木有问题。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
7楼2011-05-14 10:47:57
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+2): 谢谢 2011-05-14 18:41:22
C-JingX(金币+4): 2011-07-08 21:18:37
质粒上的位点不大会有问题的,酶切的问题更有可能。是什么质粒,毗邻到底是隔了多少个碱基,能不能用相隔远一点的位点?重新设计一对引物。只有这两个酶可以用是什么意思?

我还是想问,切不开是什么意思,切的是载体还是质粒,依据什么实验结果来判断切不开?
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2011-05-14 17:18:35
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C-JingX

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2011-05-14 01:10:48:
首先我们分析一下,是切不开还是连不上
1.由于这两个酶切微点毗邻,你拿载体另外一个位置上的酶切位点分别和它们这两个做双酶切,鉴定一下这两个酶切位点能否切开。(电泳检测)
2.理论上,一个平末端和一个粘末 ...

我做过很多中方法:1、PCR后与T载体连接,转JM109,几乎全是蓝斑,好不容易有个阳性,提取质粒,酶切,但切不开。
2、直接将我的目的基因和要连接的质粒进行双酶切后转DH5a,PCR检测发现全为假阳性。因为酶切后没有立即检测,所以不知道是否切开,也进行过分步酶切。
走自己的路,不要追逐别人的脚步!
9楼2011-05-14 18:36:36
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C-JingX

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yguang at 2011-05-14 05:49:33:
你要做的连接方向很关键吗?如果不是,直接该做EcoRI单酶切再连接,换一下片段酶切位点就行了,如果很关键,还是这样做,然后挑几个白斑测序选出你要的方向即可!

很关键,我也想做单酶切,呵呵,就是觉得切了以后还要辨认方向,辨认方向会不会很难?
走自己的路,不要追逐别人的脚步!
10楼2011-05-14 18:38:30
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