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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 双酶切切不开
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C-JingX

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-14 17:18:35:
质粒上的位点不大会有问题的，酶切的问题更有可能。是什么质粒，毗邻到底是隔了多少个碱基，能不能用相隔远一点的位点？重新设计一对引物。只有这两个酶可以用是什么意思？

我还是想问，切不开是什么意思，切的 ...

是我们实验室自己构建的一个质粒，两个酶切位点之间没有任何碱基，而且质粒上的酶切位点除了EcoR I和EcoR V以外，其他酶切位点在我的目的基因上都有，所以不能用啊
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
11楼2011-05-14 18:44:02
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
Originally posted by C-JingX at 2011-05-14 18:38:30:
很关键，我也想做单酶切，呵呵，就是觉得切了以后还要辨认方向，辨认方向会不会很难？

还好吧，用一条载体上的引物和目的片段上的引物，pcr就能鉴定出来连接方向了。不过单酶切要去磷酸化的，要不全是自链的
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
12楼2011-05-14 19:45:01
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
Originally posted by C-JingX at 2011-05-14 18:36:36:
我做过很多中方法：1、PCR后与T载体连接，转JM109，几乎全是蓝斑，好不容易有个阳性，提取质粒，酶切，但切不开。
2、直接将我的目的基因和要连接的质粒进行双酶切后转DH5a，PCR检测发现全为假阳性。因为酶切 ...

质粒大么，可否设计引物扩增质粒，在引物上加上酶切位点，
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
13楼2011-05-14 19:48:00
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-05-14 21:59:02
两个酶切位点之间没有任何碱基，说不定一个酶能切，另一个酶就结合不上去了，可否用别的酶，常用的有二十多种酶，你的序列上不会全都有的，没有的酶就买，只要能买。

如果你想要构建质粒，那就把别的质粒的多克隆位点引入你现在用的质粒，大概一周就行了。

另外我觉得奇怪，你非要用这个质粒不可？你是怎么选择这个质粒的？有没有想过候选的质粒？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
14楼2011-05-14 20:00:13
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by C-JingX at 2011-05-14 18:38:30:
很关键，我也想做单酶切，呵呵，就是觉得切了以后还要辨认方向，辨认方向会不会很难？

辨认方向不难，挑几个菌落送出去测序即可！
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15楼2011-05-14 21:09:25
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