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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切条件
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切条件

最近要开始做酶切了，在研究反应条件，检索文献发现，不同实验中同一种内切酶的孵育时间竟然还不相同，有说过夜的，有的就2,3个小时的，差别还挺大。另外，有说PCR产物要先回收的，而实际上也有直接切下去，很好奇这个反应条件该怎么定下来~~~
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1楼 2011-05-12 22:46:15
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:53
dhd997(金币+3): 鼓励热心交流 2011-05-13 09:14:54
不同的酶有不同的反应条件，不同公司的酶差别也会挺大，建议参阅说明书操作。一般像TAKALA的高保真酶3个小时应该足够。对于PCR产物建议先回收吧，用试剂盒花不了多少时间，损失也不会太大。一家之言，仅凭参考
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2楼2011-05-12 23:07:31
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:49
dhd997(金币+5): 很对 2011-05-13 09:15:17
你切多久能切好就切多久，别人的只能参考，而且你不同的样品用同一种酶来切不一定切多久就能切好。就是同样的材料，不同的时候提取的纯度也不同，酶切时间也不同，就像我有一个质粒，某次提取的一切就好，另一次提取的老是切不完全。

PCR产物也是，别人的产物或许没有一点儿杂带，而你的就不一定了，人家不回收就切是因为知道能做好，而你自己的还不知道呢，别光看别人怎么做，别人的不一定适合自己。
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3楼2011-05-13 01:50:06
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:46
dhd997(金币+5): good 2011-05-13 09:15:27
酶切条件的说，说明书上1个小时就能切开。。。
但是在加保护碱基的时候有个表不知道你注意了没有
http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以参考一下
有的酶是2个小时效率就不错，但是有的要20小时才达到90%

所以保守一点的话，俺们基本都是过夜切的
时间太长也不好，怕切除星号活性

切得时候，更深一点的话，要考虑目标序列的二级结构。，所以切长点时间是首选

不过你可以切完了泡个电泳看看，多长时间能切开一目了然
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4楼2011-05-13 05:24:30
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:42
dhd997(金币+3): 鼓励一下 2011-05-13 09:15:37
TAKARA 的酶一般3个小时完全差不多了，至于回收不回收我个人认为影响不大，PCR产物可以直接没切。一般我都做50和20ul的体系，然后用10ul的连接体系连接过夜，转化的阳性率很高的。
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5楼2011-05-13 06:40:57
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 雪山飞狐7233 at 2011-05-13 06:40:57:
TAKARA 的酶一般3个小时完全差不多了，至于回收不回收我个人认为影响不大，PCR产物可以直接没切。一般我都做50和20ul的体系，然后用10ul的连接体系连接过夜，转化的阳性率很高的。

你们都用TAKARA的内切酶啊？我用的是NEB的。。。
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6楼2011-05-13 07:50:51
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cdl007 at 2011-05-13 05:24:30:
酶切条件的说，说明书上1个小时就能切开。。。
但是在加保护碱基的时候有个表不知道你注意了没有
http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以参考一下
有的酶是2个小时效率就不错，但是有的要20小时才 ...

嗯，谢谢，我看过那张表格了，那上面木有我做的内切酶~~~
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7楼2011-05-13 07:54:29
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-13 01:50:06:
你切多久能切好就切多久，别人的只能参考，而且你不同的样品用同一种酶来切不一定切多久就能切好。就是同样的材料，不同的时候提取的纯度也不同，酶切时间也不同，就像我有一个质粒，某次提取的一切就好，另一次提 ...

嗯，对，我发现同一种酶不同公司的说明书上孵育温度还不同呢。。。。
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8楼2011-05-13 07:55:23
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xwsooo

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 如果把你的问题汇总一下，发个资源帖，也可以帮助大家啊 2011-05-13 09:16:11
引用回帖:
Originally posted by liukgg at 2011-05-12 23:07:31:
不同的酶有不同的反应条件，不同公司的酶差别也会挺大，建议参阅说明书操作。一般像TAKALA的高保真酶3个小时应该足够。对于PCR产物建议先回收吧，用试剂盒花不了多少时间，损失也不会太大。一家之言，仅凭参考

俺那个说明书木有写参考反应体系。。但有这样一些文字：
16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme.

survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours
是不是可以参照这些设计体系？
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9楼2011-05-13 08:02:19
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励 2011-05-13 17:51:00
按照酶的催化活性，2,3小时足够了，但是考虑到特殊情况，还是切到4小时以上，嘿嘿，没啥好追究的
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10楼2011-05-13 10:16:54
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 10:34:38
你定的酶都有说明书的，可以按着那个说明书来 看看酶切时间是多少
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11楼2011-05-13 10:22:09
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
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xwsooo(金币+2): 非常感谢 2011-05-13 15:17:05
dhd997(金币+5): 鼓励交流 2011-05-13 15:21:46
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-05-12 22:46:15:
最近要开始做酶切了，在研究反应条件，检索文献发现，不同实验中同一种内切酶的孵育时间竟然还不相同，有说过夜的，有的就2,3个小时的，差别还挺大。另外，有说PCR产物要先回收的，而实际上也有直接切下去，很好奇 ...

不同内切酶，不同公司产品都有所不同，如果做双酶切最好选用同一家公司的，因为同一公司会为双酶切准备公用buffer。各种离子浓度时影响酶切效率的关键之一。至于酶切时间，都是不同的，每个公司以及不同的没都有区别，你可以仔细看他们的产品说明书，一般是比较大的一本书上，上面都有，上面还有好多注意事项和例子什么的，讲的很详细。酶切时间和酶的加入量要根据具体情况调配。单酶切和双酶切即使酶相同，也是有区别的，因为双酶切换用了公用buffer，降低酶的效率，所以有时候要加大个别酶的加入量或延长反应时间，才能完全酶切好。至于是否需要回收，这个回答是肯定的，最好回收，要么就纯化。因为PCR的Buffer与内切酶是不一样的，即使成分一样，含量也有差别，肯定会有影响的，有些人不回收也做出来了，那是运气好，正好那酶的Buffer跟PCR的相似或那酶对Buffer要求不高。但要是没切出来，那就要注意一下了。祝你实验顺利！
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12楼2011-05-13 10:36:25
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bbwalkman at 2011-05-13 10:22:09:
你定的酶都有说明书的，可以按着那个说明书来 看看酶切时间是多少

嗯，是有说明书，上面说了孵育温度，但没有写酶切时间啊，只有这样一些文字：
16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme.

survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours
是不是可以参照这些设计体系？
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13楼2011-05-13 10:36:40
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疯狂修行者

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-05-13 10:36:40:
嗯，是有说明书，上面说了孵育温度，但没有写酶切时间啊，只有这样一些文字：
16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the ...

如果还搞不定，那就打电话给技术支持喽，反正咱消费了，他们会帮助结果的，在大说书后面都有，免费的电话。
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14楼2011-05-13 10:38:51
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如来神掌

捐助贵宾 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-13 17:57:32
xwsooo(金币+1): 2011-05-13 18:55:21
PCR产物一般是回收以后 才进行酶切的

拿不准时间 就切3－5个小时 试试看后续链接的效果
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15楼2011-05-13 17:25:32
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