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酶切条件
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最近要开始做酶切了，在研究反应条件，检索文献发现，不同实验中同一种内切酶的孵育时间竟然还不相同，有说过夜的，有的就2,3个小时的，差别还挺大。另外，有说PCR产物要先回收的，而实际上也有直接切下去，很好奇这个反应条件该怎么定下来~~~ |
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2楼2011-05-12 23:07:31
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:49
dhd997(金币+5): 很对 2011-05-13 09:15:17
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dhd997(金币+5): 很对 2011-05-13 09:15:17
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你切多久能切好就切多久，别人的只能参考，而且你不同的样品用同一种酶来切不一定切多久就能切好。就是同样的材料，不同的时候提取的纯度也不同，酶切时间也不同，就像我有一个质粒，某次提取的一切就好，另一次提取的老是切不完全。 PCR产物也是，别人的产物或许没有一点儿杂带，而你的就不一定了，人家不回收就切是因为知道能做好，而你自己的还不知道呢，别光看别人怎么做，别人的不一定适合自己。 |
3楼2011-05-13 01:50:06
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:46
dhd997(金币+5): good 2011-05-13 09:15:27
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dhd997(金币+5): good 2011-05-13 09:15:27
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酶切条件的说，说明书上1个小时就能切开。。。 但是在加保护碱基的时候有个表不知道你注意了没有 http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以参考一下 有的酶是2个小时效率就不错，但是有的要20小时才达到90% 所以保守一点的话，俺们基本都是过夜切的 时间太长也不好，怕切除星号活性 切得时候，更深一点的话，要考虑目标序列的二级结构。，所以切长点时间是首选 不过你可以切完了泡个电泳看看，多长时间能切开一目了然 |
4楼2011-05-13 05:24:30
5楼2011-05-13 06:40:57
6楼2011-05-13 07:50:51
7楼2011-05-13 07:54:29
8楼2011-05-13 07:55:23
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dhd997(金币+2): 如果把你的问题汇总一下，发个资源帖，也可以帮助大家啊 2011-05-13 09:16:11
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俺那个说明书木有写参考反应体系。。但有这样一些文字： 16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme. survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours 是不是可以参照这些设计体系？ |
9楼2011-05-13 08:02:19
10楼2011-05-13 10:16:54
11楼2011-05-13 10:22:09
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xwsooo(金币+2): 非常感谢 2011-05-13 15:17:05
dhd997(金币+5): 鼓励交流 2011-05-13 15:21:46
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不同内切酶，不同公司产品都有所不同，如果做双酶切最好选用同一家公司的，因为同一公司会为双酶切准备公用buffer。各种离子浓度时影响酶切效率的关键之一。至于酶切时间，都是不同的，每个公司以及不同的没都有区别，你可以仔细看他们的产品说明书，一般是比较大的一本书上，上面都有，上面还有好多注意事项和例子什么的，讲的很详细。酶切时间和酶的加入量要根据具体情况调配。单酶切和双酶切即使酶相同，也是有区别的，因为双酶切换用了公用buffer，降低酶的效率，所以有时候要加大个别酶的加入量或延长反应时间，才能完全酶切好。至于是否需要回收，这个回答是肯定的，最好回收，要么就纯化。因为PCR的Buffer与内切酶是不一样的，即使成分一样，含量也有差别，肯定会有影响的，有些人不回收也做出来了，那是运气好，正好那酶的Buffer跟PCR的相似或那酶对Buffer要求不高。但要是没切出来，那就要注意一下了。祝你实验顺利！ |
12楼2011-05-13 10:36:25
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嗯，是有说明书，上面说了孵育温度，但没有写酶切时间啊，只有这样一些文字： 16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme. survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours 是不是可以参照这些设计体系？ |
13楼2011-05-13 10:36:40
14楼2011-05-13 10:38:51
15楼2011-05-13 17:25:32