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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切条件
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切条件

最近要开始做酶切了，在研究反应条件，检索文献发现，不同实验中同一种内切酶的孵育时间竟然还不相同，有说过夜的，有的就2,3个小时的，差别还挺大。另外，有说PCR产物要先回收的，而实际上也有直接切下去，很好奇这个反应条件该怎么定下来~~~
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1楼 2011-05-12 22:46:15
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xwsooo

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 如果把你的问题汇总一下，发个资源帖，也可以帮助大家啊 2011-05-13 09:16:11
引用回帖:
Originally posted by liukgg at 2011-05-12 23:07:31:
不同的酶有不同的反应条件，不同公司的酶差别也会挺大，建议参阅说明书操作。一般像TAKALA的高保真酶3个小时应该足够。对于PCR产物建议先回收吧，用试剂盒花不了多少时间，损失也不会太大。一家之言，仅凭参考

俺那个说明书木有写参考反应体系。。但有这样一些文字：
16-hour incubationg:a 50 ul reaction containing 1 ug of DNA and 50 units of enzyme incubated for 16 hours results in the same pattern of DNAbands as a reaction incubated for 1 hour with 1 unit of enzyme.

survival in a reaction :a minimum of 0.13 unit is required to digest 1 ug of substrate DNA in 16 hours
是不是可以参照这些设计体系？
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9楼2011-05-13 08:02:19
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:53
dhd997(金币+3): 鼓励热心交流 2011-05-13 09:14:54
不同的酶有不同的反应条件，不同公司的酶差别也会挺大，建议参阅说明书操作。一般像TAKALA的高保真酶3个小时应该足够。对于PCR产物建议先回收吧，用试剂盒花不了多少时间，损失也不会太大。一家之言，仅凭参考
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2楼2011-05-12 23:07:31
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:49
dhd997(金币+5): 很对 2011-05-13 09:15:17
你切多久能切好就切多久，别人的只能参考，而且你不同的样品用同一种酶来切不一定切多久就能切好。就是同样的材料，不同的时候提取的纯度也不同，酶切时间也不同，就像我有一个质粒，某次提取的一切就好，另一次提取的老是切不完全。

PCR产物也是，别人的产物或许没有一点儿杂带，而你的就不一定了，人家不回收就切是因为知道能做好，而你自己的还不知道呢，别光看别人怎么做，别人的不一定适合自己。
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3楼2011-05-13 01:50:06
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:46
dhd997(金币+5): good 2011-05-13 09:15:27
酶切条件的说，说明书上1个小时就能切开。。。
但是在加保护碱基的时候有个表不知道你注意了没有
http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以参考一下
有的酶是2个小时效率就不错，但是有的要20小时才达到90%

所以保守一点的话，俺们基本都是过夜切的
时间太长也不好，怕切除星号活性

切得时候，更深一点的话，要考虑目标序列的二级结构。，所以切长点时间是首选

不过你可以切完了泡个电泳看看，多长时间能切开一目了然
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4楼2011-05-13 05:24:30
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