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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切条件
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切条件

最近要开始做酶切了，在研究反应条件，检索文献发现，不同实验中同一种内切酶的孵育时间竟然还不相同，有说过夜的，有的就2,3个小时的，差别还挺大。另外，有说PCR产物要先回收的，而实际上也有直接切下去，很好奇这个反应条件该怎么定下来~~~
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1楼 2011-05-12 22:46:15
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:49
dhd997(金币+5): 很对 2011-05-13 09:15:17
你切多久能切好就切多久，别人的只能参考，而且你不同的样品用同一种酶来切不一定切多久就能切好。就是同样的材料，不同的时候提取的纯度也不同，酶切时间也不同，就像我有一个质粒，某次提取的一切就好，另一次提取的老是切不完全。

PCR产物也是，别人的产物或许没有一点儿杂带，而你的就不一定了，人家不回收就切是因为知道能做好，而你自己的还不知道呢，别光看别人怎么做，别人的不一定适合自己。
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3楼2011-05-13 01:50:06
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:53
dhd997(金币+3): 鼓励热心交流 2011-05-13 09:14:54
不同的酶有不同的反应条件，不同公司的酶差别也会挺大，建议参阅说明书操作。一般像TAKALA的高保真酶3个小时应该足够。对于PCR产物建议先回收吧，用试剂盒花不了多少时间，损失也不会太大。一家之言，仅凭参考
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2楼2011-05-12 23:07:31
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:46
dhd997(金币+5): good 2011-05-13 09:15:27
酶切条件的说，说明书上1个小时就能切开。。。
但是在加保护碱基的时候有个表不知道你注意了没有
http://lvxh.bokee.com/3953618.html 可以参考一下
有的酶是2个小时效率就不错，但是有的要20小时才达到90%

所以保守一点的话，俺们基本都是过夜切的
时间太长也不好，怕切除星号活性

切得时候，更深一点的话，要考虑目标序列的二级结构。，所以切长点时间是首选

不过你可以切完了泡个电泳看看，多长时间能切开一目了然
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4楼2011-05-13 05:24:30
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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xwsooo(金币+1): 2011-05-13 07:49:42
dhd997(金币+3): 鼓励一下 2011-05-13 09:15:37
TAKARA 的酶一般3个小时完全差不多了，至于回收不回收我个人认为影响不大，PCR产物可以直接没切。一般我都做50和20ul的体系，然后用10ul的连接体系连接过夜，转化的阳性率很高的。
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5楼2011-05-13 06:40:57
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