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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物与T载体连不上 求助
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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物与T载体连不上 求助

PCR产物与PMD-19 T载体连接 16度过夜
然后转化感受态细胞后挑单克隆 菌液PCR检测的结果全为假阳性 我的片段大小差不多200bp左右 这个实验重复了3次了 还是不行 我连接的体系为载体1ul DNA 4ul soultion I 5ul 用的是宝生物的连接试剂盒 感受态细胞换过一次 都是从公司买的 后来看网上说天根的感受态好不错 我就试了一下 发现还是假阳性 愁死了
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1楼 2011-05-11 17:06:26
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hnsdly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+1): 谢谢 2011-05-11 21:03:35
多做几个对照，查找问题。
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2楼2011-05-11 17:15:23
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hnsdly at 2011-05-11 17:15:23:
多做几个对照，查找问题。

我这次打算将AMP IPTG X-GAL全换掉 要是这些换掉还有问题的话咋办
怎么作对照才好呢？
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3楼2011-05-11 17:24:53
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glucidum

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-11 19:52:54
syn1985(金币+2): 谢谢 2011-05-11 21:03:58
你用的什么DNA聚合酶?高保真DNA聚合酶产物不能用做TA连接的。
不知道长出来的克隆多不多,如果挺多的话至少说明连接反应没有问题。问题出在你的片段上。
此外,要注意长出来的菌落是真的转化子，还是其他相同抗性菌的污染。确保各试剂没有相同抗性菌污染。
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4楼2011-05-11 17:39:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-11 19:53:00
syn1985(金币+2): 谢谢 2011-05-11 21:04:11
1:连接体系没有问题吗？一般DNA比载体多一点。。。16度过夜连接。
2：感受态细胞活性也会影响你连接和转化的效率。。。
不过还是得找出问题所在。
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-05-11 18:12:22
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-05-11 17:06:26:
PCR产物与PMD-19 T载体连接 16度过夜
然后转化感受态细胞后挑单克隆 菌液PCR检测的结果全为假阳性 我的片段大小差不多200bp左右 这个实验重复了3次了 还是不行 我连接的体系为载体1ul DNA 4ul soultion I 5ul 用 ...

我也是用宝生物的pMD19-T载体做的，体系和你的一样，片段是600bp左后，但我连接的时候是16度30分钟，没有过夜，感受态细胞用的天根的TOP 10，每次都能成啊！你转化感受态后有没有做蓝白斑筛选啊？还有你的菌落ＰＣＲ是怎么做的啊，是直接以菌液为模板的吗，还是裂解后离心取上清为模板啊？
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6楼2011-05-11 18:25:37
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by glucidum at 2011-05-11 17:39:13:
你用的什么DNA聚合酶?高保真DNA聚合酶产物不能用做TA连接的。
不知道长出来的克隆多不多,如果挺多的话至少说明连接反应没有问题。问题出在你的片段上。
此外,要注意长出来的菌落是真的转化子，还是其他相同抗性 ...

我用的是rtaq 所以可以直接做TA的，平板上长出来的克隆很多，可是随机挑取5个都是假阳性的 而且这5个还是靠近蓝斑旁边挑的， 我不太懂你为啥说克隆多就表明连接反应没问题啊 我觉得连接反应是没问题 但是全是T载体自连了
长出来的菌落应该是转化子 因为做菌液PCR 用的通用引物 通用引物扩出来了100多BP片段了
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7楼2011-05-11 18:37:29
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-11 18:25:37:
我也是用宝生物的pMD19-T载体做的，体系和你的一样，片段是600bp左后，但我连接的时候是16度30分钟，没有过夜，感受态细胞用的天根的TOP 10，每次都能成啊！你转化感受态后有没有做蓝白斑筛选啊？还有你的菌落 ...

我做菌落PCR用的是菌液稀释一倍后煮沸10Min 然后取5Ul PCR的 我做了篮白斑筛选啊
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8楼2011-05-11 18:38:32
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
syn1985(金币+1): 谢谢 2011-05-11 21:04:24
西瓜(金币+4): 鼓励分享经验 2011-05-12 01:08:22
引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-05-11 18:38:32:
我做菌落PCR用的是菌液稀释一倍后煮沸10Min 然后取5Ul PCR的 我做了篮白斑筛选啊

我以前好像听人说过直接用菌液不太好P，我用的是菌液离心，用双蒸水悬浮沉淀，100度水浴5分钟裂解菌液，然后离心以上清为模板做ＰＣＲ，你可以尝试一下！
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9楼2011-05-11 19:22:03
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-11 19:22:03:
我以前好像听人说过直接用菌液不太好P，我用的是菌液离心，用双蒸水悬浮沉淀，100度水浴5分钟裂解菌液，然后离心以上清为模板做ＰＣＲ，你可以尝试一下！

我也是用沸水裂解了啊 呵呵
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10楼2011-05-11 21:03:16
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