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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物与T载体连不上 求助
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szylnl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！我以前也差不多，不过Taq酶是一起加了的，95℃用5分钟。 2011-05-12 01:09:22
syn1985(金币+1): 谢谢 2011-05-12 09:13:31
前面都差不多，我做菌落PCR是先把引物和mix加好，然后用牙签挑一下单菌落，放在PCR管里搅一下，然后在PCR仪上设计一个95℃，10分钟的程序，之后再加上Taq酶，不知道你这样做会怎样。
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用百分之百的努力去做每件事
11楼2011-05-11 22:41:17
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-05-11 21:03:16:
我也是用沸水裂解了啊 呵呵

那就不清楚了，我一般阳性克隆率在80%吧，你一个都挑不到未免也太不走运了吧，你一般一次挑几个菌落啊？如果是挑白色菌落按理说不应该啊，建议你PCR的时候做一个阳性对照，我感觉你的问题是不是出在PCR上了啊！
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12楼2011-05-11 23:47:56
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glucidum

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 热心哦 2011-05-12 12:01:10
引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-05-11 18:37:29:
我用的是rtaq 所以可以直接做TA的，平板上长出来的克隆很多，可是随机挑取5个都是假阳性的 而且这5个还是靠近蓝斑旁边挑的， 我不太懂你为啥说克隆多就表明连接反应没问题啊 我觉得连接反应是没问题 但是全是T ...

TA连接会有自连现象，有自连就说明酶什么的都是正常的，否则自连也无法发生的。
还有两个问题或许你也要注意一下:
(1)你的PCR特异性好不好,纯化后有没有小片段产物?如果有的话也会发生插入，而且理论上将小片段的效率要高于大片段。
(2)你的目的片段只有200bp,你看一下插入后对半乳糖苷酶alpha亚基的读码框有没有影响，如果会发生移码,那确定应该是白斑；如果不会造成移码，那你就多挑几个蓝斑试试。
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13楼2011-05-12 06:23:25
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by szylnl at 2011-05-11 22:41:17:
前面都差不多，我做菌落PCR是先把引物和mix加好，然后用牙签挑一下单菌落，放在PCR管里搅一下，然后在PCR仪上设计一个95℃，10分钟的程序，之后再加上Taq酶，不知道你这样做会怎样。

我以前也这么做过 不过那是菌斑比较大的情况下 要不然的话就挑没了
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14楼2011-05-12 09:09:51
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by glucidum at 2011-05-12 06:23:25:
TA连接会有自连现象，有自连就说明酶什么的都是正常的，否则自连也无法发生的。
还有两个问题或许你也要注意一下:
(1)你的PCR特异性好不好,纯化后有没有小片段产物?如果有的话也会发生插入，而且理论上将小片 ...

我PCR产物一条带 是切胶回收 不是纯化的
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15楼2011-05-12 09:12:46
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+1): 刚开始做这种实验的时候我也觉得很好连 随着时间的推移 做的越多发现越难连 2011-05-12 11:26:47
应该是pcr不好P，你可以粗提质粒跑个电泳看看，和阴性对照对比一下。
一般16度过夜肯定能连上，很好连的。
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16楼2011-05-12 09:40:29
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sfb1020 at 2011-05-12 09:40:29:
应该是pcr不好P，你可以粗提质粒跑个电泳看看，和阴性对照对比一下。
一般16度过夜肯定能连上，很好连的。

我用的是兼并引物 宝生物的RV和M4 退火温度设了55度  我买宝生物这个引物的时候上面也没写要多少度退火 我记得以前老师说过这个什么温度都能P出来 所以就设了个一般的温度 也不晓得是不是温度不太合适
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17楼2011-05-12 11:25:52
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syn1985

木虫 (正式写手)
我这次排除了x-gal IPTG还有Amp的问题 我挑了10个做PCR 结果还是全都假阳性 真想不通为什么
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18楼2011-05-13 16:35:07
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+1): 谢谢 我这次重新P了 也回收后跑了胶 上样2ul 能看到条带 我觉得这浓度应该是可以的吧 2011-05-16 13:30:09
你把回收的片段跑胶看看浓度，搞不好是没回收到
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在等待中涅槃重生
19楼2011-05-13 16:49:11
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+1): 宝生物的T载体不稳定啊 2011-05-16 13:30:32
我从不做菌落PCR，每次都是提质粒做酶切，而且我用的国产全式金的Peasy-T1载体，200bp片段也就用个25度5分钟就连上了，并且是amp和kan双抗载体，不用蓝白斑得到的菌落基本全是阳性。
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20楼2011-05-14 13:49:51
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