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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物与T载体连不上 求助
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
证实片段没问题了，最多连一个小时就好了
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在等待中涅槃重生
21楼2011-05-16 13:45:19
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syn1985

木虫 (正式写手)
谢谢各位的热心 原因找到了 是我的通用引物出了问题 我需要去面壁 竟然连引物二聚体和条带都分不清楚
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22楼2011-05-20 13:33:04
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振子

新虫 (小有名气)
200bp，你这个体系连的话最多两三个小时就可以了，是不是连的太久载体自连了都
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23楼2012-05-24 16:03:27
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振子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
986201楼: Originally posted by syn1985 at 2011-05-12 09:09:51:
我以前也这么做过 不过那是菌斑比较大的情况下 要不然的话就挑没了

可以先用单斑划线然后挑一半菌扩PCR，另一半可以继续用来划单斑
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24楼2012-05-24 16:08:12
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振子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
1342970楼: Originally posted by syn1985 at 2011-05-20 13:33:04:
谢谢各位的热心 原因找到了 是我的通用引物出了问题 我需要去面壁 竟然连引物二聚体和条带都分不清楚

想问下引物出了什么问题，因为我的也是连不上，筛阳性也都是空载体酶什么的都没问题，和别人一块做的，别人的出来了我的就不行，郁闷好长时间了，一直在找原因，谢谢！
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25楼2012-05-24 16:12:20
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
1560992楼: Originally posted by 振子 at 2012-05-24 16:12:20:
想问下引物出了什么问题，因为我的也是连不上，筛阳性也都是空载体酶什么的都没问题，和别人一块做的，别人的出来了我的就不行，郁闷好长时间了，一直在找原因，谢谢！

我是在宝生物他们家买原装的M13引物扩不出来 换成自己合成或者原先扩基因的引物就没问题 我那个不是连不上 只是检测出了问题 你这个如果检测没问题的话那应该是你目的基因浓度不够 加大浓度吧 既然人家做出来了 应该不是检测手段和连接酶的问题了
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26楼2012-05-24 19:33:25
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
T载体真的会自连么..到哪加两个A呀......

对照很好做啊..你每次换一个东西..阳性对照,阴性对照都要做好...这是基本习惯啊..不然出问题哭都不知道..也浪费时间..
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27楼2013-05-20 08:59:23
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by xjtu0025 at 2013-05-20 08:59:23
T载体真的会自连么..到哪加两个A呀......

对照很好做啊..你每次换一个东西..阳性对照,阴性对照都要做好...这是基本习惯啊..不然出问题哭都不知道..也浪费时间..

新手吧 T载体自连的现象不要太普遍 还有一般做T载体连接不需要做对照 浪费试剂和精力 写文章也用不上
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28楼2013-05-20 12:35:04
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
楼主你的T连接是16摄氏度过夜啊？这个不好吧？
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船到桥头自然直
29楼2013-06-21 17:29:00
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋
回收的dna最好测浓度，然后再和t载体连接，一般要0.3pmol，
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30楼2013-06-21 23:50:55
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