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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物与T载体连不上 求助
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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物与T载体连不上 求助

PCR产物与PMD-19 T载体连接 16度过夜
然后转化感受态细胞后挑单克隆 菌液PCR检测的结果全为假阳性 我的片段大小差不多200bp左右 这个实验重复了3次了 还是不行 我连接的体系为载体1ul DNA 4ul soultion I 5ul 用的是宝生物的连接试剂盒 感受态细胞换过一次 都是从公司买的 后来看网上说天根的感受态好不错 我就试了一下 发现还是假阳性 愁死了
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1楼 2011-05-11 17:06:26
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sfb1020 at 2011-05-12 09:40:29:
应该是pcr不好P，你可以粗提质粒跑个电泳看看，和阴性对照对比一下。
一般16度过夜肯定能连上，很好连的。

我用的是兼并引物 宝生物的RV和M4 退火温度设了55度  我买宝生物这个引物的时候上面也没写要多少度退火 我记得以前老师说过这个什么温度都能P出来 所以就设了个一般的温度 也不晓得是不是温度不太合适
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17楼2011-05-12 11:25:52
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hnsdly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

syn1985(金币+1): 谢谢 2011-05-11 21:03:35
多做几个对照，查找问题。
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2楼2011-05-11 17:15:23
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hnsdly at 2011-05-11 17:15:23:
多做几个对照，查找问题。

我这次打算将AMP IPTG X-GAL全换掉 要是这些换掉还有问题的话咋办
怎么作对照才好呢？
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3楼2011-05-11 17:24:53
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glucidum

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-11 19:52:54
syn1985(金币+2): 谢谢 2011-05-11 21:03:58
你用的什么DNA聚合酶?高保真DNA聚合酶产物不能用做TA连接的。
不知道长出来的克隆多不多,如果挺多的话至少说明连接反应没有问题。问题出在你的片段上。
此外,要注意长出来的菌落是真的转化子，还是其他相同抗性菌的污染。确保各试剂没有相同抗性菌污染。
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4楼2011-05-11 17:39:13
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