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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关引物设计问题
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caojinxuan

银虫 (正式写手)

[求助] 有关引物设计问题

大家好，本人是新手，想请教有关引物设计问题，一下是要扩增的目的基因序列：

1 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa
       61 tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc
      121 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt
      181 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc
      241 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct
      301 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg
      361 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag
      421 gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg
      481 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag
      541 gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat
      601 agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat
      661 ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact
      721 ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtaaggt gactcttgct
      781 ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa
      841 aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt
      901 gttaccggca cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt
      961 gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca aaataaagat
     1021 ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg acggtacatc caaaactgca
     1081 ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa accgaagttg tttctattgg tggtaaaact
     1141 tacgctgcaa gtaaagccga aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg
     1201 gctgctacaa ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ctgctttggc acaggttgac
     1261 acgttacgtt ctgacctggg tgcggtacag aaccgtttca actccgctat taccaacctg
     1321 ggcaacaccg taaacaacct gacttctgcc cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg
     1381 accgaagttt ccaacatgtc tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ctccgttctg
     1441 gcgcaggcga accaggttcc gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa

FLICF: 5`-gggaattc CATATG gcacaag tcattaatac-3`
FLICR: 5`-ccgCTCGAG ttaacccagtaaagagaggacgt-3`
这是我设计的引物，不知道可行不可行
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1楼 2011-04-29 11:39:21
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): 应助一并奖励！ 2011-04-30 09:14:57
FLICR: 5`-ccgCTCGAG ttaacccagtaaagagaggacgt-3`
如果你给的序列是对的
这个就是错的了 应该是CGC而不是CCC吧
你加了酶切识别序列吗？
貌似你这些都没说，只说这些，没人知道到底是合适不合适
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2楼2011-04-30 05:09:15
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

caojinxuan(金币+1): 谢谢 2011-05-12 20:21:03
你这是要做表达吗
那还要看你的载体
引物中是不是要加一些碱基，不要改变了读码框
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3楼2011-04-30 05:11:37
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

caojinxuan(金币+2): 谢谢 2011-05-12 20:21:15
两个引物TM值相差很大，建议再好好看一下
一个57.7 一个是65
如果第一个引物前边是保护碱基的话，建议修改一下。来提高tm值
（也有人说tm值不应该包括保护碱基，不过偶们都是算在里边的）
不管你是新手还是什么手，基本知识还是要有的吧
ps：本人也是前几天才开始琢磨怎么设计引物
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4楼2011-04-30 06:02:38
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bluepapa

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2011-04-30 11:33:00
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caojinxuan

银虫 (正式写手)
大写的是酶切位点，可是我身边只有NdeI
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6楼2011-05-03 22:17:26
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caojinxuan

银虫 (正式写手)
我的载体用的是Pet-28a
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7楼2011-05-03 22:18:24
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 辛苦了！ 2011-05-04 00:47:56
这是不是你的载体序列 ？如果不是，请提供一下你的两个酶切之间的序列，及读码
我在网上搜的，如果不对的话，你提供一下
图谱


序列
NdeI  Type II restriction enzyme  5' CA^TATG 3'
NcoI  Type II restriction enzyme  5' C^CATGG 3'
NdeI 和NcoI 之间的序列，
C ATA TGG CTG CCG CGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATC
如果我现在给出的两个酶之间的序列是对的，那你的引物不仅退火温度相差大，
而且读码框也改变了，所以你自己多看书，好好琢磨一下吧
这是第一步，如果这里弄不好，下边做再多也没用

ps：偶是新手，如有不当之处，欢迎讨论
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8楼2011-05-03 23:27:15
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caojinxuan

银虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎探讨 2011-05-04 11:04:10
上传了我的质粒图谱和NdeI及NcoI间的序列 ，好像和楼上说的有出入
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累事经年，仰天啸月间情感俱伤 纵马横川，剑指远峰处星河灿烂
9楼2011-05-04 09:15:25
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xiaoweiwei121

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 热心！话说图我也看不到…… 2011-05-05 09:11:37
caojinxuan(金币+2): 2011-05-06 20:15:46
caojinxuan(金币+1): 谢谢 2011-05-19 16:34:18
引用回帖:
Originally posted by caojinxuan at 2011-05-04 09:15:25:
上传了我的质粒图谱和NdeI及NcoI间的序列 ，好像和楼上说的有出入



对不起
我今天打开网页 什么图片都看不到
如果你能等的话，我看到了在讨论
如果你感觉读码框没有问题的话，只是退火的问题，那就可以修改一下，去合成了
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10楼2011-05-05 00:23:16
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