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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】构建问题
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wkl1984

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】构建问题

在载体上有bsgI和NotI，相距13bp的碱基，在这2者中间再加入ApaLI的酶切位点，利用PCR做的话，引物如何设计？因为BsgI的酶切位点为GTGCAG（N）15，不知道怎么设计引物。想各位求助
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1楼 2011-04-09 21:59:47
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2011-04-09 22:37:35:
楼主可以采用加Linker的方法引入新的酶切位点，合成寡核苷酸单链引物后，退火成双链再与载体连接即可。

我没有做过，但是加Linker的话，不是很好加，引物对繁多，而且连接上不是很容易，我想先PCR加入酶切位点，以后就直接用克隆序贯比较容易一点。这只是这么说说，不知道可不可以提供一些参考呢
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3楼2011-04-10 12:59:00
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
wkl1984(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-04-10 00:46:08
楼主可以采用加Linker的方法引入新的酶切位点，合成寡核苷酸单链引物后，退火成双链再与载体连接即可。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-04-09 22:37:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
wkl1984(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+3): 细心，热心的空谷幽风~ 2011-04-11 14:19:34
引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-04-09 21:59:47:
在载体上有bsgI和NotI，相距13bp的碱基，在这2者中间再加入ApaLI的酶切位点，利用PCR做的话，引物如何设计？因为BsgI的酶切位点为GTGCAG（N）15，不知道怎么设计引物。想各位求助

我查的是BsgI在识别序列后面第14个碱基处进行切割，这个酶切位点正好在你的NotI位点里（两者酶切位点重合了），这样双酶切是无法完成的，所以请你考虑换个酶切位点吧
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4楼2011-04-11 13:47:32
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