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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于PCR的模板问题
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30937747

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于PCR的模板问题

我将一段PCR得到的Kan基因连接至puc19上，然后用同一对引物，同样的条件，以我构建好的puc19-Kan质粒作为模板，想再一次的扩增Kan基因，却怎么也扩增不出来。酶切鉴定我的puc19-Kan已经成功构建。而且我通过酶切把Kan片段回收作为模板PCR，又能P出目的条带。

我想问的是，为什么同样的引物同样的条件，在我构建的质粒上就P不出来东西，而且我试了温度梯度和模板浓度梯度，但是在片段上就能P出来？
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1楼 2011-04-05 23:37:00
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wzwhq

铁虫 (小有名气)
我也遇到了相同的情况，郁闷。。。怎么回事啊？
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2楼2011-04-06 08:21:22
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)
30937747(金币+2): 本来已经联系测序了。但是片段又P出来了。就证明没有问题.就没有测了 2011-04-06 10:07:29
楼主先测下序继续确认一下吧，如确认再换换引物扩下试试？
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4楼2011-04-06 08:44:14
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amilie030312

金虫 (正式写手)
30937747(金币+1): 质粒我检测过了,没有什么问题.puc19也应该不会对GC含量有太大影响 2011-04-06 14:48:52
首先看质粒是否被不纯的内切酶切掉了一部分，没办法和引物序列匹配了，测序就知道结果了，其次看一下加上质粒之后扩增的酶是否有能力扩增那么长的片段或者加上质粒之后是否GC含量有了很大变化，扩增酶是否是耐受高GC的。
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5楼2011-04-06 12:56:23
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yuhongquan78083楼
2011-04-06 08:32   回复  
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