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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】做实时定量PCR需要校正内参吗？
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做实时定量PCR需要校正内参吗？

实验室的同事做Real-time PCR 之前 都要先做半定量PCR，校正内参，只有内参条带亮度相差无几时才做实时定量， 校正内参有必要吗
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1楼 2011-03-22 23:16:48
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poog502

木虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
首先没搞明白
既然你半定量就把内参校正好了，好做什么Real-time PCR，直接用半定量的结果就可以说明问题了。
显然，我的做法是首先半定量确定引物的特异性（单一条带，亮）
其次，根据提取RNA的浓度，大致保证反转录后所有的样品浓度较为一致，也可以核酸测定仪准确确定浓度
第三，Real-time PCR后将样品减去内参的Ct值，内参本来就是消除误差的。
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2楼2011-03-23 08:21:39
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-03-23 08:21:39:
首先没搞明白
既然你半定量就把内参校正好了，好做什么Real-time PCR，直接用半定量的结果就可以说明问题了。
显然，我的做法是首先半定量确定引物的特异性（单一条带，亮）
其次，根据提取RNA的浓度，大致保证 ...

样品的RNA浓度差异不影响吗
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3楼2011-03-25 23:56:45
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-03-25 23:56:45:
样品的RNA浓度差异不影响吗

内参本来就是消除样品量差异的，起始RNA浓度高了，内参信号就强，反之亦然。校正内参没必要。
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4楼2011-03-26 00:28:05
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suuny

木虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-03-25 23:56:45:
样品的RNA浓度差异不影响吗

这个是有影响的！ 虽然有一定的容忍度。
尽量保证RT前所用的RNA量一致。
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5楼2011-03-26 05:00:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
如果不是相差特别大，无所谓~~
一般9个数量级以内线性都挺好，如果体系引物各方面没问题
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6楼2011-03-26 09:35:44
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poog502

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2011-03-26 09:35:44:
如果不是相差特别大，无所谓~~
一般9个数量级以内线性都挺好，如果体系引物各方面没问题

是这样的
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7楼2011-03-26 13:52:52
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lixingliang

新虫 (小有名气)

内参变化幅度大

★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
内参的CT值在多大才行，变化幅度在多少范围才合适
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8楼2011-04-08 13:16:07
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adi623

新虫 (初入文坛)
★
xnbioinfor(金币+1): 谢谢参与
我的实验要测细胞外游离DNA，内参不见得好用，老师让我每份样本都测DNA浓度，做质量定量用来矫正内参，我没听懂啥意思，，每板都要测一个浓度梯度，用来校正板与板之间的差距，完全不明白是什么意思，各位大神能指点一下么

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9楼2016-03-25 11:47:26
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adi623

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by poog502 at 2011-03-23 08:21:39
首先没搞明白
既然你半定量就把内参校正好了，好做什么Real-time PCR，直接用半定量的结果就可以说明问题了。
显然，我的做法是首先半定量确定引物的特异性（单一条带，亮）
其次，根据提取RNA的浓度，大致保证反 ...

请问不用内参可以么，直接用其次里的浓度质量定量
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10楼2016-03-30 19:26:50
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