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汕头大学海洋科学接受调剂
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】做实时定量PCR需要校正内参吗?

实验室的同事做Real-time PCR 之前 都要先做半定量PCR,校正内参,只有内参条带亮度相差无几时才做实时定量, 校正内参有必要吗
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adi623

新虫 (初入文坛)



xnbioinfor(金币+1): 谢谢参与
我的实验要测细胞外游离DNA,内参不见得好用,老师让我每份样本都测DNA浓度,做质量定量用来矫正内参,我没听懂啥意思,,每板都要测一个浓度梯度,用来校正板与板之间的差距,完全不明白是什么意思,各位大神能指点一下么

发自小木虫IOS客户端
9楼2016-03-25 11:47:26
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poog502

木虫 (正式写手)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
首先没搞明白
既然你半定量就把内参校正好了,好做什么Real-time PCR,直接用半定量的结果就可以说明问题了。
显然,我的做法是首先半定量确定引物的特异性(单一条带,亮)
其次,根据提取RNA的浓度,大致保证反转录后所有的样品浓度较为一致,也可以核酸测定仪准确确定浓度
第三,Real-time PCR后将样品减去内参的Ct值,内参本来就是消除误差的。
2楼2011-03-23 08:21:39
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by poog502 at 2011-03-23 08:21:39:
首先没搞明白
既然你半定量就把内参校正好了,好做什么Real-time PCR,直接用半定量的结果就可以说明问题了。
显然,我的做法是首先半定量确定引物的特异性(单一条带,亮)
其次,根据提取RNA的浓度,大致保证 ...

样品的RNA浓度差异不影响吗
3楼2011-03-25 23:56:45
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xnbioinfor at 2011-03-25 23:56:45:
样品的RNA浓度差异不影响吗

内参本来就是消除样品量差异的,起始RNA浓度高了,内参信号就强,反之亦然。校正内参没必要。
4楼2011-03-26 00:28:05
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