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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关氯仿-异戊醇
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关氯仿-异戊醇

我配的氯仿：异戊醇（24:1）用来提DNA，以前做的没什么大问题，不知道最近为什么加完氯仿异戊醇，漩涡震荡15s后，离心后，蛋白质层不能完全离心沉淀下去（分成了两层）？试剂也刚配过不久，不知道怎么突然这样了，很焦急~~~
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1楼 2011-03-17 10:22:04
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xwsooo

银虫 (小有名气)
还有一个问题：我是用碘化钠法提取外周血DNA，我发现配的碘化钠溶液（棕色瓶中，避光保存）一个礼拜就貌似变氧化了（变成黄色了），不知道有什么解决办法？？
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2楼2011-03-17 11:11:55
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xwsooo

银虫 (小有名气)
自己先顶一下。。。
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3楼2011-03-17 15:21:40
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yesucao

木虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
我提过细菌的DNA，氯仿-异戊醇只是抽提时用的，是分成两层，收集上清就可以了啊，再加其他的东西沉淀DNA。
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4楼2011-03-17 15:31:22
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-17 11:11:55:
还有一个问题：我是用碘化钠法提取外周血DNA，我发现配的碘化钠溶液（棕色瓶中，避光保存）一个礼拜就貌似变氧化了（变成黄色了），不知道有什么解决办法？？

每次用 新配
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5楼2011-03-17 16:57:08
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kyoya

金虫 (初入文坛)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
氯仿与其他试剂不互溶的，而且密度大，可定会在下层的。你只要把沉淀上层的上清液提取出来就行了！
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6楼2011-03-17 20:25:39
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yesucao at 2011-03-17 15:31:22:
我提过细菌的DNA，氯仿-异戊醇只是抽提时用的，是分成两层，收集上清就可以了啊，再加其他的东西沉淀DNA。

这个我明白，氯仿是使蛋白质变性，异戊醇能减少震荡产生气泡，问题是抽提后后拿去离心，本应该蛋白质（中间层）和水相（上层）分清楚，可是最近不知道为什么蛋白质往往有些混到水相上面了，也就是蛋白质没有完全离心下来，不知道问什么
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7楼2011-03-17 21:22:04
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by kyoya at 2011-03-17 20:25:39:
氯仿与其他试剂不互溶的，而且密度大，可定会在下层的。你只要把沉淀上层的上清液提取出来就行了！

这个我明白，氯仿是使蛋白质变性，异戊醇能减少震荡产生气泡，问题是抽提后后拿去离心，本应该有机相（下层），蛋白质（中间层）和水相（上层）分清楚，可是最近不知道为什么蛋白质往往有些混到水相上面了，也就是蛋白质没有完全离心下来，不知道问什么
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8楼2011-03-17 21:22:56
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xwsooo

银虫 (小有名气)
另外，氯仿，异戊醇会互溶吗?
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9楼2011-03-18 09:40:14
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lcy1971

银虫 (小有名气)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
可能蛋白质太多了，一次离心除不净，可吸上清后再离心一次。
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11楼2011-03-18 10:08:59
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jjwl_rscn

金虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
走过路过不要错过
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12楼2011-03-19 15:12:42
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-17 10:22:04:
我配的氯仿：异戊醇（24:1）用来提DNA，以前做的没什么大问题，不知道最近为什么加完氯仿异戊醇，漩涡震荡15s后，离心后，蛋白质层不能完全离心沉淀下去（分成了两层）？试剂也刚配过不久，不知道怎么突然这样了， ...

我是用公司的成品。棕色瓶装，保存在4°冰箱里。用时拿出来。没啥问题，况且做质粒DNA提取时，分层比较明显呀~
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13楼2011-03-19 15:57:46
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shan-sa

金虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
充分混匀一下~
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14楼2011-03-19 17:11:40
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by weishengsu5 at 2011-03-18 09:55:07:

真是不靠谱
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15楼2011-03-19 18:31:46
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by shan-sa at 2011-03-19 17:11:40:
充分混匀一下~

靠谱
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16楼2011-03-19 18:33:19
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-17 21:22:04:
这个我明白，氯仿是使蛋白质变性，异戊醇能减少震荡产生气泡，问题是抽提后后拿去离心，本应该蛋白质（中间层）和水相（上层）分清楚，可是最近不知道为什么蛋白质往往有些混到水相上面了，也就是蛋白质没有完全 ...

抽提两次呢？试过没？？
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18楼2011-03-19 19:46:39
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
蛋白质层在中间也正常啊
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19楼2011-03-19 20:16:54
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yesucao at 2011-03-19 19:46:39:
抽提两次呢？试过没？？

。。。太麻烦了，问题是本该一次解决的问题。。。
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20楼2011-03-20 15:24:20
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 辛雨237 at 2011-03-19 20:16:54:
蛋白质层在中间也正常啊

问题是蛋白质经常混到水相那层，造成吸取上清时很不好弄
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21楼2011-03-20 15:25:08
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-20 15:25:08:
问题是蛋白质经常混到水相那层，造成吸取上清时很不好弄

你用多大转速离心啊
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22楼2011-03-20 18:13:42
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 辛雨237 at 2011-03-20 18:13:42:
你用多大转速离心啊

12,000rpm，10min
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23楼2011-03-21 08:46:15
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辛雨237

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-03-24 08:34:49
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-03-21 08:46:15:
12,000rpm，10min

不知道你提的什么的基因组，如果是海洋生物的话，DNA是不太好提
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24楼2011-03-21 09:04:40
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 辛雨237 at 2011-03-21 09:04:40:
不知道你提的什么的基因组，如果是海洋生物的话，DNA是不太好提

谢谢MM安慰，可惜偶提的不是海洋生物，就是俺们人的外周血~~
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25楼2011-03-22 10:21:00
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-03-24 08:35:06
氯仿/异戊醇肯定会互溶，我觉得可能是时间太长了，试剂不能充分使蛋白变性，建议使用新配置的。
还有，其实你取上清就行，尽量不吸到蛋白，或者来个二次离心。
赞一下(2人) 回复此楼
26楼2011-03-22 12:25:06
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linyanfei

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): 鼓励新虫交流 2011-03-24 08:35:28
可以直接买一瓶新的已经配好的呀，那样要方便些，基本上也不会出什么问题
赞一下(2人) 回复此楼
27楼2011-03-22 21:18:52
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-22 12:25:06:
氯仿/异戊醇肯定会互溶，我觉得可能是时间太长了，试剂不能充分使蛋白变性，建议使用新配置的。
还有，其实你取上清就行，尽量不吸到蛋白，或者来个二次离心。

灰常感谢
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28楼2011-03-23 20:22:44
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另一个天堂

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
要不试试加酚抽提，配置酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），抽提时混匀15后静止1min，再离心（可重复一次效果会更好），我们老师说的，我也这样做
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29楼2011-03-27 19:10:20
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wanyifei0123

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
LZ的体系里面盐离子含量高吗？当NaCL一类的物质浓度较高时会影响分层甚至可以使有机相与无机相反转位置。
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30楼2013-04-23 09:24:27
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孟浩浩

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我认为你可以用酚氯仿多抽一次，我做实验室基本上用两次，或者多次
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31楼2013-04-23 11:19:13
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HAxiaoyun

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好！我想请教你一些问题？我在网上看到你之前用氯仿异戊醇提取血液中DNA出现了抽提效果不好的问题，我现在也是遇到了这个问题，我是才接触没多久，老师说是我操作的问题，但是现在其他人做也是同样的结果，试了几种原因，仍然找不到原因，各种试剂都是新配没多久，能吸出部分水相，但是PCR检测不出来，现在很焦急，请问你的实验问题解决了吗？是怎么解决的啊？到底是什么问题啊？我现在很急，老师崔的紧，实验也紧，能帮我分析一下吗？
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32楼2013-10-21 17:08:32
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卫小誊

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，我也碰到和你一样的问题了，你当时是怎么解决的？
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33楼2015-07-28 09:23:14
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李明芳Eva

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，请教一个问题，我从人外周血提取总RNA，基本实验步骤是这样的：
全血总的提取
将冷冻血解冻并转入的离心管中，加入等体积的去灭菌蒸
懷水，充分混勻后静置30min
将离心管放入离心机，离心30min
弃上清，加入等体积（即的充分混勻，放入离心机，离
心；
弃上清，在另一离心管中加入，将离心管中剩余的沉淀
转入新的离心管中，充分吹打混勻后室温静置30min
加入氯仿，震荡混勾，室温下静置，然后却多数管没有出现分层的情况，只有几个有，我用的是现成的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），为什么分层不理想呢？楼主帮忙分析下原因好吗？谢谢
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34楼2016-01-05 19:55:22
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简单回复
weishengsu510楼
2011-03-18 09:55   回复  
xwsooo(金币+1):谢谢参与
大志子17楼
2011-03-19 19:25   回复  
xwsooo(金币+1):谢谢参与
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