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【求助/交流】质粒双酶切连接问题 已有7人参与
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有一个关于质粒双酶切的问题一直没弄明白。 双酶切连接转化完以后，一个菌里面会不会有许多不同大小的质粒存在。有的是酶切连接正确的，有的是质粒自身连接的，还有的是没有连接上的。 如果是这样的话，那么提质粒其实是把这些不同大小的质粒都提取出来了么？ |
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2楼2011-02-28 14:14:44
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其实，这是一个很好的问题。 连接时，如楼主所说，会出现各种连接产物：包括载体A:单载体分子的自连产物，B:两个载体分子的自连产物，C:目的基因与载体正确连接的产物，D:两个目的基因的自连产物等等 转化时，这些不同的连接产物，完全有可能进入同一个感受态细胞。但是这些连接产物中，只有两种是可以复制的：那就是A和C 那为什么在通常情况下，没有出现一个单克隆中出现两种不同的质粒呢？ 事实上，这就涉及到质粒的一个特性：质粒的不相容性。一般认为，如果两种质粒的复制原点相同，那么这两个质粒不可能共存于同一个大肠杆菌细胞中（即在分裂时，一般为随机丢失一种质粒，最终表现为只有一种质粒存在于一个单克隆中）。质粒不相容性的原因有些不同的假说，貌似到现在还不是特别清楚。 但是质粒的不相容性也就保证了单克隆中只有一种质粒，虽然我们不知道为什么。这也是能够进行分子克隆的一个基本原理。 但现在越来越多的事实表明，质粒的不相容性并不是那么严格，这个现象在文库构建时表现的比较明显，在单克隆测序时，经常会发现出现重峰现象，这通常就是因为单克隆繁殖起来的群体中含有两种质粒（插入序列不同的克隆） |
8楼2012-03-27 21:50:32
