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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】真菌分子鉴定问题
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冰鱼儿

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】真菌分子鉴定问题 已有7人参与

真菌分子鉴定里必须用到载体连接吗？急~~~
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1楼 2011-02-25 17:14:45
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guozhibin

银虫 (小有名气)
应该不是吧，用真菌的rDNA通用引物ITS扩增出来后，直接测序就可以了。
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2楼2011-02-25 21:04:04
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ottolzm

木虫 (正式写手)
★ ★
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翱宇(金币+1): 鼓励交流 2011-02-25 21:33:47
用不用载体 取决于你的实验室 得到纯化后的真菌遗传指针信息 然后送交测序公司即可(但是像上海生工这样的公司 会要求你的DNA 的浓度为OD260/OD280到1.8至2.0 而且要你提供引物 如果是经典的比如18S等的 则不要 否则经常会测不出信号 如果实验室钱多 那就送到TaKaRa 日本人的服务很全面 而且质量可靠 但是价钱奇贵)   如果你们实验室做载体连接比较多 那就连个载体 再送出去测序 同样也要提供引物 但这样的话 可能会便宜一点 但是这样就将测序的一部分风险转嫁到你自己的因素上了 所以 这完全取决于你的选择了 祝你好运
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3楼2011-02-25 21:15:21
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)

让一切随风飞翔
★ ★ ★
scelab(金币+3): 谢谢交流 2011-02-26 09:52:40
直接测序对回收DNA的要求比较高，有可能测不出来；
但是连接载体有可能连接上PCR过程中错配的；
综上，选择连接载体的，多送几个样，同时在PCR过程中选用高保真的酶
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一直向前！
4楼2011-02-26 09:14:46
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
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lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-02-27 18:21:11
不用连接，让测序公司电泳回收，直接把PCR产物送测，省时省力省钱，四天后能得到结果。

这样的帖子这几天有三张，加上以前的就更多了，楼主发帖之前先站内搜索一下就明白了，省力得多。不过楼主是昨天才加入的新人，以后会学会这招的。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-02-26 12:59:41
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冰鱼儿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-26 12:59:41:
不用连接，让测序公司电泳回收，直接把PCR产物送测，省时省力省钱，四天后能得到结果。

这样的帖子这几天有三张，加上以前的就更多了，楼主发帖之前先站内搜索一下就明白了，省力得多。不过楼主是昨天才加入的 ...

弱弱的问一句，这个电泳回收是什么意思?
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6楼2011-02-27 10:54:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
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rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-02-27 16:24:35
不要紧，问吧。

因为PCR可能有非特异性扩增，造成除了目的条带之外还有干扰条带产生，他们都是用同一对引物扩增得来的，所以在测定序列的时候会在同一个碱基的位置上出现两个碱基反应同等强度，不知道正确的序列中应该是其中的哪一个，所以为了保证产物纯度，最保险的方法就是将PCR产物跑电泳，回收预计大小的条带。我以前是在有杂带时就会回收才送测，现在是写明目的条带在哪里，直接将PCR产物送测，让他们回收。花费是稍微多一点，但我的样品有二十几个，一个人回收要很久，公司人多，这样我得到结果就快得多。
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7楼2011-02-27 14:20:26
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冰鱼儿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-02-27 14:20:26:
不要紧，问吧。

因为PCR可能有非特异性扩增，造成除了目的条带之外还有干扰条带产生，他们都是用同一对引物扩增得来的，所以在测定序列的时候会在同一个碱基的位置上出现两个碱基反应同等强度，不知道正确的序 ...

你的意思是跑完电泳后，连胶一起送去让他们回收纯化，然后测序？
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8楼2011-02-27 16:05:41
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
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dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-02-28 10:44:43
PCR完了之后跑电泳，看到有想要的产物产生，就将PCR产物送去测序。你们实验室没人做过？
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9楼2011-02-27 16:13:39
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个实际操作，应该是比较常用的，

如果不会的话，问问实验室的师兄师姐比较容易明白。
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千万不要因为走的太久，而忘记了我们为什么出发~~~~~~ForDream~~~~~~
10楼2011-02-27 16:25:44
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