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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】反转录过程中的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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Allanflying

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】反转录过程中的问题 已有3人参与

大家好，想问一下高手们，提出来的RNA质量不错，但是如果反转录最后一步，高温使反转录酶失活的反应失败的话，会不会影响我做后续的RT-PCR实验？
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1楼 2011-02-15 23:53:13
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★ ★
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dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-02-16 10:37:28
据我所知    反转录如果失败  就得不到CDNA，没有CDNA的话，你后面的实验是无法进行的。
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2楼2011-02-16 09:35:06
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军
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dhd997(金币+2): good 2011-02-17 11:03:41
楼主只是最后一步反转录酶失活没成功，cDNA应该还是有的，可以扩增基因，其实你可以将你的反应液再扔到70度水浴十分钟也行啊，扩增基因时建议50ul体系使用1ul反应液，以高保真酶扩增！
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3楼2011-02-16 13:09:49
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Allanflying

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-02-16 13:09:49:
楼主只是最后一步反转录酶失活没成功，cDNA应该还是有的，可以扩增基因，其实你可以将你的反应液再扔到70度水浴十分钟也行啊，扩增基因时建议50ul体系使用1ul反应液，以高保真酶扩增！

你说的高保真酶是ExTaq酶吗，如果我想扩的基因只有几百bp的话，就用ExTaq酶50ul体系？
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4楼2011-02-16 21:35:31
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军
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dhd997(金币+2): 热心。 2011-02-17 11:03:53
引用回帖:
Originally posted by Allanflying at 2011-02-16 21:35:31:

你说的高保真酶是ExTaq酶吗，如果我想扩的基因只有几百bp的话，就用ExTaq酶50ul体系？

我一般用KOD-plus，68度延伸的一个酶，不管要扩增的基因多长，50ul后可以跑回收胶回收，进行后续克隆操作！
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5楼2011-02-16 22:04:55
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Allanflying

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-02-16 13:09:49:
楼主只是最后一步反转录酶失活没成功，cDNA应该还是有的，可以扩增基因，其实你可以将你的反应液再扔到70度水浴十分钟也行啊，扩增基因时建议50ul体系使用1ul反应液，以高保真酶扩增！

用我说的cDNA做模板，第一步PCR出来了28SrRNA的内参基因条带，之后设计了10个基因的10对引物，包括属内特异引物，也包括简并引物，但是均没有出现想要的目的条带，郁闷之极，是什么原因啊？
出来内参基因是不是意味着反转录一定成功了啊？
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6楼2011-03-13 21:32:31
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