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Allanflying

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】反转录过程中的问题 已有3人参与

大家好,想问一下高手们,提出来的RNA质量不错,但是如果反转录最后一步,高温使反转录酶失活的反应失败的话,会不会影响我做后续的RT-PCR实验?
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军

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dhd997(金币+2): good 2011-02-17 11:03:41
楼主只是最后一步反转录酶失活没成功,cDNA应该还是有的,可以扩增基因,其实你可以将你的反应液再扔到70度水浴十分钟也行啊,扩增基因时建议50ul体系使用1ul反应液,以高保真酶扩增!
3楼2011-02-16 13:09:49
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)

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dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-02-16 10:37:28
据我所知    反转录如果失败  就得不到CDNA,没有CDNA的话,你后面的实验是无法进行的。
2楼2011-02-16 09:35:06
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Allanflying

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-02-16 13:09:49:
楼主只是最后一步反转录酶失活没成功,cDNA应该还是有的,可以扩增基因,其实你可以将你的反应液再扔到70度水浴十分钟也行啊,扩增基因时建议50ul体系使用1ul反应液,以高保真酶扩增!

你说的高保真酶是ExTaq酶吗,如果我想扩的基因只有几百bp的话,就用ExTaq酶50ul体系?
4楼2011-02-16 21:35:31
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翱宇

禁虫 (正式写手)

将军

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dhd997(金币+2): 热心。 2011-02-17 11:03:53
引用回帖:
Originally posted by Allanflying at 2011-02-16 21:35:31:

你说的高保真酶是ExTaq酶吗,如果我想扩的基因只有几百bp的话,就用ExTaq酶50ul体系?

我一般用KOD-plus,68度延伸的一个酶,不管要扩增的基因多长,50ul后可以跑回收胶回收,进行后续克隆操作!
5楼2011-02-16 22:04:55
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