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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr反应目的条带很浅，引物二聚体很亮
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pxm0705

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】pcr反应目的条带很浅，引物二聚体很亮

请问一下各位高手，我PCR反应后目的条带
很浅,引物二聚体条带很亮,是什么原因?之前预做过几次都没有出现这样的问题,条件,引物.模板都没有变.谢谢!这是出现问题的图片(最下面的一条是60bp左右的引物二聚体)
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1楼 2011-01-16 22:14:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xp198766

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢分享 2011-01-18 15:36:42
我的经验是，在冰上面做PCR，可以明显减少二聚体！
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17楼2011-01-17 10:41:58
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普通回帖

翱宇

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-01-17 09:18:35
你的PCR条件是什么呢？（退火温度，PCR循环数，延伸时间）我感觉可以提高退火温度，可以做个温度梯度PCR，然后跑琼脂糖胶看结果。其实一般都有引物二聚体的，只要目标条带很亮就行，我怎么看你有两条带，究竟哪一条是你所需要的呢？
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2楼2011-01-16 22:23:38
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
我也遇到同样的问题。想问问如何优化反应条件的呢。引物是特异的，但是始终扩出来有多条带！
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3楼2011-01-17 05:47:10
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1): 经验之谈？ 2011-01-17 09:18:54
提个建议，绝不是做广告。可以试试NEB公司的超保真酶Phusion,效果应该不错。
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5楼2011-01-17 08:31:01
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qqm8445

金虫 (正式写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-01-17 09:19:12
会不会是引物降解了呀？以前师姐好像遇到过这样的问题，再重新稀释一管引物试下
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6楼2011-01-17 08:42:28
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xingxing342

银虫 (小有名气)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-01-17 09:19:28
引物不要反复冻融，分装一下；
适当提高退火温度试试。
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8楼2011-01-17 09:16:36
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
朋友也遇到同样的问题。
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9楼2011-01-17 09:18:50
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funny8125

银虫 (小有名气)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
我也觉得，目的条带好像有2条呢。原来我学习做PCR的时候，师姐说，等PCR仪升到72度以后再把加好的样放进PCR仪里面，那样可以减少引物二聚体！
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10楼2011-01-17 09:36:53
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-01-18 15:35:55
大部分的有两条带，最后一组有三条带呀
可能引物还是有点特异性不是很强的问题吧，LZ可以Blast一下
非特异性条带可以适当提高一下Tm
引物二聚体可以等PCR仪升上去以后再开始反应
可以在反应管中加入适量的BSA，DMSO。。。可以减少非特异性反应
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11楼2011-01-17 09:42:58
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sfb1020

金虫 (小有名气)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
提高退火温度试试
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12楼2011-01-17 09:49:03
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甲子沫

金虫 (正式写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-01-18 15:36:10
退火温度和酶都很重要，建议做下温度梯度实验和更换新的酶
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13楼2011-01-17 09:53:28
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 胶回收是个方法 2011-01-18 15:36:29
提高退火温度，实际上也无所谓了。做个胶回收。
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14楼2011-01-17 09:58:42
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mlw8486

银虫 (正式写手)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
可以把退火温度提高点看看
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15楼2011-01-17 10:18:17
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zhuimengren639

荣誉版主 (文坛精英)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
帮顶!咨询一下师兄师姐最好
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16楼2011-01-17 10:27:48
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-01-18 15:36:59
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-01-17 05:47:10:
我也遇到同样的问题。想问问如何优化反应条件的呢。引物是特异的，但是始终扩出来有多条带！

换模板。做巢式
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18楼2011-01-17 13:35:37
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
我也是遇到过这样的情况，后来改正了——退火时间太长导致酶失活了，就缩短退火时间呗。  活着就是酶活性的问题，也建议你换酶。
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19楼2011-01-17 20:33:56
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
优化下pcr条件，可以试着改动下引物序列，应该是引物序列的配对序列太高。
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20楼2011-01-18 12:07:18
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haitian0625

金虫 (小有名气)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
引物问题，应该重换引物。
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22楼2011-01-18 14:49:24
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ma2007

银虫 (初入文坛)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
减少引物的量，50 ul 体系，10P 前后引物各加 1ul 足够
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23楼2011-01-18 15:31:43
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
先优化条件
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24楼2011-01-18 15:38:00
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
如果你的PCR产物够用，就不要考虑其他的操作了，
如果不够用，重新设计一下引物，提高特异性，
提高PCR产量的方法有很多种，但换Taq酶一般差别不会特别显著。
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26楼2011-01-18 17:09:17
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mihriban

禁虫 (初入文坛)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
27楼2011-01-29 20:29:07
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pop_hjx_41

铜虫 (初入文坛)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
我pcr的时候也会有这样的问题 如果引物的量降低一下 会不会好一点呢 请高手们解决一下帮忙一起
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29楼2011-02-03 22:39:56
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mrzouhao

木虫之王 (文坛精英)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by xingxing342 at 2011-01-17 09:16:36:
引物不要反复冻融，分装一下；
适当提高退火温度试试。

可以参考
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30楼2011-02-04 00:32:51
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happy！！

金虫 (著名写手)
★
pxm0705(金币+1):谢谢参与
优化下pcr条件
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31楼2011-02-06 00:16:33
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mrzouhao

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by xingxing342 at 2011-01-17 09:16:36:
引物不要反复冻融，分装一下；
适当提高退火温度试试。

正确
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32楼2011-02-06 15:25:43
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)
★
pxm0705(金币+1): 谢谢参与
循环数增加点看看呢
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33楼2013-05-16 13:05:20
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简单回复
?磭Y壹笑4楼
2011-01-17 08:14   回复  
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wg4237楼
2011-01-17 08:54   回复  
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tammie21楼
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helmhlotz25楼
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