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henkally

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[资源] 【原创】非变性凝胶电泳原理及应用实例已有1人参与

现在大家都是做SDS-PAGE或者双向电泳比较多，而做非变性电泳的似乎少一些。而我本人接触非变形电泳较多，一直认为它还是很有特点的，能够有很多独特应用之处的，所以在此结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。

非变性电泳，蛋白质在电泳过程中是处于非变性的，电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷和分子量，非变性电泳在完成电泳后，可以进行蛋白质活性测定（如果是酶的话，可以进行酶活检测）或者检测同功酶，或含亚基的完整蛋白的分子量，这些特点是SDS-PAGE所不具备的，因为像SDS-PAGE使蛋白变性，亚基解离，无法体现含有亚基的蛋白的真实分子量，也无法进行后续的蛋白活性检测了。
非变性电泳和SDS-PAGE相比，其实基本试验操作是相同的，所以在此我也不一一详叙了。最大的不同就是样品中的蛋白是没有变性的，所以电泳样品是没有煮沸的，而且样品处理液中也是不含去垢剂的。此外的差异还有：
1：在非变性电泳中，体系的PH通常为8.8（浓缩胶和分离胶的PH 8.8）因而大多数蛋白质在这个条件下是带负电的。当然我想地球上也会有pI大于8.8的蛋白质，这样的条件下，要用低PH系统（这个完全是另一套系统，缓冲体系也不同，我这里就不深入了，有兴趣的可以去参考一下汪家政主编的《蛋白质技术手册》），同时把电泳体系得阴极和阳极倒置就好了，蛋白往胶里跑就行。
2：非变性电泳体系中的离子强度尽量不要太高，离子强度高了会影响蛋白活性；在电泳的时候发热也比较厉害。但如果离子强度太低了，可能导致非特异性凝聚。我一般缓冲体系（Tris-Hcl）的离子强度在0.01-0.1mol/L，离子强度是要比SDS-PAGE低的。配胶时Tris-Hcl浓度同样是要低的。
3：虽然电泳产热比起western电转是少很多了，但是还是不能忽视啊~所以我一般做非变性电泳还是会用冰浴的，安全起见嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不会用冰浴。
4：因为蛋白质未变性，含有亚基的蛋白肯定更大，泳动速度也慢（非变性条件下，蛋白所带的电荷一般来说也更少），胶的浓度还是小点好，5%-10%就行，我做catalase的非变性电泳胶的浓度是7%（后面我会给一些操作和应用实例，和图片）。SDS-PAGE的条带区分开主要是靠分子量大小，而非变性电泳的话，分子量和所带电荷的多少都是影响因素，这个值得注意。
下面我讲两个应用实例，这样让大家也能体会到非变性电泳的实际用途。（这两个例子都是本人做的，谢绝转载哦）
第一个例子：电泳检测胰蛋白活力，
这个试验是当初我做蛋白纯化时候做的一个试验，挺有意思的，活性电泳的试验结果证实了我当初从一个公司买的胰蛋白酶粗品没有酶活，真的是一点都没有！那个公司的伪劣产品严重干扰了我的试验进度，最后我还是从肉联厂买的胰脏，自己从头提取。（这个惨痛的经历一直教育我，试验材料和试剂什么的，一定要从有信誉的公司买啊）。
现在和大家分享一下具体细节：试验用的其实是SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的；而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时，就可以用R250染色了。
在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的），可以检测胰蛋白酶所处的条带，而且条带宽度能体现量效关系。还是给图比较直观：（图1）

对了，给篇参考文献：《用于植物光系统II蛋白酶检测的活性染色方法》

好，继续。
第二个例子是我做的过氧化氢酶catalase的活性电泳。
这个体系中就没有SDS了，样品处理液中我连β-巯基乙醇都没加。分离胶浓度为7%（pH 8.8），浓缩胶浓度为4%（pH 6.8）。提取的蛋白样品用2×样品处理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚蓝，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。
过氧化氢酶的染色采用负染色，用蒸馏水将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶冲洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝胶5 min，在浸泡过程中不断震荡染色盘，使之浸泡均匀。浸泡结束后，倒掉H2O2液，用蒸馏水将凝胶冲洗2次。再用50 mL2%铁氰化钾和50 mL2%三氯化铁混合液进行负染色10分钟。直到凝胶在蓝紫色背景上出现草绿色酶带时停止染色。倒掉染色液后，用蒸馏水冲洗凝胶2次。在这里，顺便给个染色后的效果图：（图2）

我做的植物材料只有一种catalase同工酶。其实在很多植物中catalase同功酶还是比较多的，所以往往有好几条带，同工酶还往往是分类，种属鉴定的辅助手段，同工酶和非变性电泳的用途，大家可以参考以下《电泳》一书（主编何忠效，张树政），讲得比我好多啦。里面胶的配方也讲得很详细。

讲到这里就差不多啦，欢迎大家来此讨论。（我打字打了好久啊，原创的啊）

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1楼2011-01-07 19:46:54

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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

引用回帖:

Originally posted by henkally at 2011-01-07 19:46:54:
现在和大家分享一下具体细节：试验用的其实是SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的；而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时，就可以用R250染色了。
在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的），可以检测胰蛋白酶所处的条带，而且条带宽度能体现量效关系。还是给图比较直观：（图1）

1、“SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的”，这样能够使多少蛋白质，或者说你的目的蛋白质保持活性？是否不加变性剂，有助于更多的蛋白质保持活性？有没有想过这个问题？有没有测定过目的蛋白质得率？
2、“而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS”。既然要清洗，为什么要加SDS？
3、“用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时”。有没有考虑过此时能有多少目的蛋白质在电泳胶中？有多少在清洗和温浴中损失掉了？
4、“就可以用R250染色了”。R250应为考染。
5、“在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的”。
没有脱色步骤，是否说明即使不用脱色，考马斯亮蓝也不能把没有明胶的地方染蓝？如果有脱色步骤，那么本来处在明胶降解带处的酶哪里去了？
“（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的）”
说明在漂洗和温浴（保持环境恒定让酶降解明胶）的过程中跑出凝胶了？

请楼主解惑