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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 【原创】非变性凝胶电泳原理及应用实例
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henkally

禁虫 (著名写手)

[资源] 【原创】非变性凝胶电泳原理及应用实例 已有1人参与

现在大家都是做SDS-PAGE或者双向电泳比较多，而做非变性电泳的似乎少一些。而我本人接触非变形电泳较多，一直认为它还是很有特点的，能够有很多独特应用之处的，所以在此结合我本人经历向大家介绍一下非变性电泳。

非变性电泳，蛋白质在电泳过程中是处于非变性的，电泳时蛋白的迁移率取决于蛋白的电荷和分子量，非变性电泳在完成电泳后，可以进行蛋白质活性测定（如果是酶的话，可以进行酶活检测）或者检测同功酶，或含亚基的完整蛋白的分子量，这些特点是SDS-PAGE所不具备的，因为像SDS-PAGE使蛋白变性，亚基解离，无法体现含有亚基的蛋白的真实分子量，也无法进行后续的蛋白活性检测了。
非变性电泳和SDS-PAGE相比，其实基本试验操作是相同的，所以在此我也不一一详叙了。最大的不同就是样品中的蛋白是没有变性的，所以电泳样品是没有煮沸的，而且样品处理液中也是不含去垢剂的。此外的差异还有：
1：在非变性电泳中，体系的PH通常为8.8（浓缩胶和分离胶的PH 8.8）因而大多数蛋白质在这个条件下是带负电的。当然我想地球上也会有pI大于8.8的蛋白质，这样的条件下，要用低PH系统（这个完全是另一套系统，缓冲体系也不同，我这里就不深入了，有兴趣的可以去参考一下汪家政主编的《蛋白质技术手册》），同时把电泳体系得阴极和阳极倒置就好了，蛋白往胶里跑就行。
2：非变性电泳体系中的离子强度尽量不要太高，离子强度高了会影响蛋白活性；在电泳的时候发热也比较厉害。但如果离子强度太低了，可能导致非特异性凝聚。我一般缓冲体系（Tris-Hcl）的离子强度在0.01-0.1mol/L，离子强度是要比SDS-PAGE低的。配胶时Tris-Hcl浓度同样是要低的。
3：虽然电泳产热比起western电转是少很多了，但是还是不能忽视啊~所以我一般做非变性电泳还是会用冰浴的，安全起见嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不会用冰浴。
4：因为蛋白质未变性，含有亚基的蛋白肯定更大，泳动速度也慢（非变性条件下，蛋白所带的电荷一般来说也更少），胶的浓度还是小点好，5%-10%就行，我做catalase的非变性电泳胶的浓度是7%（后面我会给一些操作和应用实例，和图片）。SDS-PAGE的条带区分开主要是靠分子量大小，而非变性电泳的话，分子量和所带电荷的多少都是影响因素，这个值得注意。
下面我讲两个应用实例，这样让大家也能体会到非变性电泳的实际用途。（这两个例子都是本人做的，谢绝转载哦）
第一个例子：电泳检测胰蛋白活力，
这个试验是当初我做蛋白纯化时候做的一个试验，挺有意思的，活性电泳的试验结果证实了我当初从一个公司买的胰蛋白酶粗品没有酶活，真的是一点都没有！那个公司的伪劣产品严重干扰了我的试验进度，最后我还是从肉联厂买的胰脏，自己从头提取。（这个惨痛的经历一直教育我，试验材料和试剂什么的，一定要从有信誉的公司买啊）。
现在和大家分享一下具体细节：试验用的其实是SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的；而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时，就可以用R250染色了。
在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的），可以检测胰蛋白酶所处的条带，而且条带宽度能体现量效关系。还是给图比较直观：（图1）


对了，给篇参考文献：《用于植物光系统II蛋白酶检测的活性染色方法》

好，继续。
第二个例子是我做的过氧化氢酶catalase的活性电泳。
这个体系中就没有SDS了，样品处理液中我连β-巯基乙醇都没加。分离胶浓度为7%（pH 8.8），浓缩胶浓度为4%（pH 6.8）。提取的蛋白样品用2×样品处理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚蓝，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。
过氧化氢酶的染色采用负染色，用蒸馏水将电泳后的聚丙烯酰胺凝胶冲洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝胶5 min，在浸泡过程中不断震荡染色盘，使之浸泡均匀。浸泡结束后，倒掉H2O2液，用蒸馏水将凝胶冲洗2次。再用50 mL2%铁氰化钾和50 mL2%三氯化铁混合液进行负染色10分钟。直到凝胶在蓝紫色背景上出现草绿色酶带时停止染色。倒掉染色液后，用蒸馏水冲洗凝胶2次。在这里，顺便给个染色后的效果图：（图2）


我做的植物材料只有一种catalase同工酶。其实在很多植物中catalase同功酶还是比较多的，所以往往有好几条带，同工酶还往往是分类，种属鉴定的辅助手段，同工酶和非变性电泳的用途，大家可以参考以下《电泳》一书（主编何忠效，张树政），讲得比我好多啦。里面胶的配方也讲得很详细。

讲到这里就差不多啦，欢迎大家来此讨论。（我打字打了好久啊，原创的啊）
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1楼 2011-01-07 19:46:54
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

楼主够热情，同时我也想介绍一些我的看法和做法，借楼主宝地，还请不要介意。与楼主不同之处，可能是因为做的蛋白质不同，就当丰富主帖内容，无对错之分。
1、蛋白质形状也会影响在非变性电泳中的泳动速度，不是所有蛋白质都是球状或者几乎是球状的，例如有些有CBM的纤维素酶，或者某些有长链糖基化修饰的蛋白质。
2、即使是变性电泳，蛋白质也可以进行复性尝试，可以复性，但不知道是不是已经100%复性，没计算过比例。例如纤维素酶。
3、是否需要把电泳槽放在冰水混合物中不仅与缓冲液的离子强度有关，还与缓冲液使用次数有关，如果目的蛋白质耐高温，那也不用这样费事。
4、跑完电泳之后要染色，漂洗不用那么多步骤，泡久了蛋白质会有一点跑到溶液里去的，不知道楼主是否测定过漂洗过后有多少蛋白质跑了出来，或者蛋白质带变宽，似乎有一个所谓的“固定”说法。我只用清水荡涤一下就行，大多数情况是从电泳槽里拿出来之后直接考染，没那么多步骤。

既然楼主热情，我就给5星评价。
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10楼2011-01-30 17:23:06
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by henkally at 2011-01-07 19:46:54:
现在和大家分享一下具体细节：试验用的其实是SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的；而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时，就可以用R250染色了。
在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的），可以检测胰蛋白酶所处的条带，而且条带宽度能体现量效关系。还是给图比较直观：（图1）

1、“SDS-PAGE体系，但是样品上样前是没有煮沸的”，这样能够使多少蛋白质，或者说你的目的蛋白质保持活性？是否不加变性剂，有助于更多的蛋白质保持活性？有没有想过这个问题？有没有测定过目的蛋白质得率？
2、“而在电泳完成后，用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS”。既然要清洗，为什么要加SDS？
3、“用Tris-Hcl缓冲液清洗分离胶，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃温育8小时”。有没有考虑过此时能有多少目的蛋白质在电泳胶中？有多少在清洗和温浴中损失掉了？
4、“就可以用R250染色了”。R250应为考染。
5、“在分离胶里是加了明胶的，作用在于胰蛋白酶能降解明胶，按上述步骤处理过后，就可以染色，整块胶被R250染成蓝色背景，而被胰蛋白酶降解的区域不会被染色，仍为透明的”。
没有脱色步骤，是否说明即使不用脱色，考马斯亮蓝也不能把没有明胶的地方染蓝？如果有脱色步骤，那么本来处在明胶降解带处的酶哪里去了？
“（这和通常凝胶的考马斯亮蓝染色结果正好相反的）”
说明在漂洗和温浴（保持环境恒定让酶降解明胶）的过程中跑出凝胶了？


请楼主解惑
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12楼2011-01-31 15:30:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
看样子讨论结果已经几乎明了了，我再赘言几句：
1、SDS含量多少对各种蛋白质的变性作用应该是有可能不同的，所以我觉得在做非变性电泳时能否用SDS-PAGE体系，能用的话怎么样用，这值得思考。SDS对蛋白质活性的抑制作用是否都是可逆的，这也值得摸索各人实验各自摸索。
2、对于我来说，如果想知道淀粉酶有没有活力，可以使用更直接的方法，测定酶活力就行，测定过程只需要十分钟，但做一个电泳来验证有没有活性，从样品准备跑胶到染色一系列下来至少5小时。所以楼主说那个实验是用来验证有没有活性的，我就觉得是不是楼主的胰蛋白酶在那个实验阶段是不是仍不适宜测定酶活力？底物是否只用明胶最合适？而不适宜用酪蛋白之类的底物来测定？既然楼主在后面的纯化中要计算得率，那么所用来测定酶活力的方法是什么？能不能代替非变性胶这个耗时长的实验来检测蛋白酶有无活力？会不会更省时？
3、我知道做细胞内全蛋白质的染色可以只染半小时就能清楚看到几十条蛋白质带的，而你所说的胰蛋白酶染色需要较长时间，这是否与染色液有关？考马斯亮蓝与蛋白质结合很稳定的，你染不上，是所用考马斯亮蓝浓度特别低还是染色过程极其短？你说的时间很短，究竟有多短？在提取非变性胶里的蛋白质的时候有人是把胶切碎浸泡，使蛋白质从胶里跑出来的，所以我有一个疑问，你的胰蛋白酶是不是在漂洗和浸泡过程中跑掉了所以只有降解带而没有蛋白质带？

放假了，回家不能做实验不能进库看文献，所以才有空纠结一下小木虫，如果楼主忙就不要管我这个闲人了。
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14楼2011-01-31 22:01:22
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
39楼: Originally posted by protein780 at 2014-08-11 09:41:57
你好，请问亲和时蛋白缓冲液的pH是2.5，直接按照通常的方法加入变性胶的loading处理上样，会因为样品ph太低，影响跑胶结果吗？...

你的上样缓冲液也能起到缓冲作用的，如果你还是担心，你加样品之前就加电泳缓冲液漫过胶孔，加样品的时候慢一些，让蛋白质样品和电泳缓冲液的接触时间多几秒，你可能就会发现溴酚蓝变蓝了。
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40楼2014-08-11 11:13:42
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