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汕头大学海洋科学接受调剂
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yrr032

新虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验,在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利,但这次按照常规建立的体系,尝试了几次都没有连上,请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右,回收定量20ng/μl
载体大小6993bp,回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友,小弟不胜感激!(连接所用酶等均没有问题)

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ(该Mix是buffer和T4的混合物,2×),10μl的体系,目的用了2.5μl,载体用了2μl,SolutionⅠ4.5μl;又用了一次Promega的T4,也是10μl体系,目的与载体的量不变,T4 0.5μl,buffer 1μl,仍然没连上!晕倒!

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]
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郝钊

金虫 (小有名气)


★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
从数据来看,你的载体浓度相对于目的基因来说比较低,加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接,比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的,前两次也是不行,第三次重新制备了一些载体,浓度提高了一些,最后连接成功了。我用的是20μl体系(1μl T4 ligase,2μl buffer,剩余的17μl除了载体就是目的基因,你根据自己的浓度来定二者的比例,建议载体多加一些,毕竟浓度比较低)。祝实验顺利……
2楼2010-12-15 15:57:15
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duanming123

木虫 (正式写手)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:42
用T4连么,6μl的基因,2μl载体,1μlbuffer, 1μl酶
3楼2010-12-15 18:08:59
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)



dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-16 09:07:36
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:56
请问,你如何确定没有连接成功?经过PCR扩增验证了吗?建议每次转化之前,对连接体系进行质粒通用引物的PCR。
4楼2010-12-16 09:03:45
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:59:16
这是大载体小片段的连接,不是很好连,可以试试低浓度的vecter高浓度的incert,最好都是新鲜制备的,连接体系的整体浓度大一点,连上应该还是没有问题的!
5楼2010-12-16 11:04:52
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


感受态的转化效率才是最重要的。
6楼2010-12-16 11:06:27
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pwj

银虫 (小有名气)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 12:30:33
用T4酶,7μl的目的片段,1μl载体片段,1μl10*buffer, 1μl酶
7楼2010-12-16 13:35:35
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 12:30:38
浓度太低,建议重新获取载体和目的片段
8楼2010-12-16 15:22:30
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2010-12-15 15:57:15:
从数据来看,你的载体浓度相对于目的基因来说比较低,加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接,比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的,前两次也是不行,第三次重新制备了一些载体,浓度提高了一 ...

朋友怎么说要多加载体呢?我认为是不是应该多加一些目的片段呢?那样会增加与载体的碰撞几率吧?
9楼2010-12-18 12:17:17
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by duanming123 at 2010-12-15 18:08:59:
用T4连么,6μl的基因,2μl载体,1μlbuffer, 1μl酶

这么多目的片段?
10楼2010-12-18 12:19:21
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by lulu1986 at 2010-12-16 09:03:45:
请问,你如何确定没有连接成功?经过PCR扩增验证了吗?建议每次转化之前,对连接体系进行质粒通用引物的PCR。

老兄,转化平板上就没菌落如何PCR?
11楼2010-12-18 12:20:23
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by srlee at 2010-12-16 11:04:52:
这是大载体小片段的连接,不是很好连,可以试试低浓度的vecter高浓度的incert,最好都是新鲜制备的,连接体系的整体浓度大一点,连上应该还是没有问题的!

是吗?我原来一直觉得小片段大载体应该挺好连的,这次情况这么糟糕让我还自责是不是自己实验水平出问题了!另外请教老兄:新鲜回收的片段与放置一段时间的回收片段对连接有太大影响吗?为什么会有影响?请赐教!
12楼2010-12-18 12:24:56
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-16 11:06:27:
感受态的转化效率才是最重要的。

感受态是买的商品化的,肯定没问题!
13楼2010-12-18 12:28:23
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-12-16 15:22:30:
浓度太低,建议重新获取载体和目的片段

你的意思是多少的浓度比较合适呢?
14楼2010-12-18 12:31:53
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:20:23:


老兄,转化平板上就没菌落如何PCR?

“连接体系”,兄台不知道是什么意思吗?我说的是“连接体系”,OK!
15楼2010-12-18 12:32:12
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yrr032

新虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by lulu1986 at 2010-12-18 12:32:12:

“连接体系”,兄台不知道是什么意思吗?我说的是“连接体系”,OK!

连接体系PCR?还真没这样做过,请指教!我觉得这样无论连没连上都应该可以P出目的片段吧?
16楼2010-12-18 12:38:06
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郝钊

金虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:17:17:


朋友怎么说要多加载体呢?我认为是不是应该多加一些目的片段呢?那样会增加与载体的碰撞几率吧?

你说的没错,浓度高了肯定碰撞的几率会增加,但是你的片段你不觉得浓度太低了嘛?稍微多加点载体,其余的加目的基因就可以了。
17楼2010-12-18 21:03:01
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:24:56:


是吗?我原来一直觉得小片段大载体应该挺好连的,这次情况这么糟糕让我还自责是不是自己实验水平出问题了!另外请教老兄:新鲜回收的片段与放置一段时间的回收片段对连接有太大影响吗?为什么会有影响?请赐教!

就是以此包含有2.5μl目的片段,2μl 载体,4.5μl SolutionⅠ的10μl体系中的0.5μl为模板,以质粒上的通用引物或者目的片段的特定引物进行扩增,跑胶观察是否连接上。
18楼2010-12-21 00:05:46
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xulanzzz

金虫 (著名写手)


建议用1微升的载体,4微升的片段,5微升的solutionI就差不多了。。。
19楼2010-12-21 10:46:05
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