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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】建个连接体系
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yrr032

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验，在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利，但这次按照常规建立的体系，尝试了几次都没有连上，请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右，回收定量20ng/μl
载体大小6993bp，回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友，小弟不胜感激！（连接所用酶等均没有问题）

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ（该Mix是buffer和T4的混合物，2×），10μl的体系，目的用了2.5μl，载体用了2μl，SolutionⅠ4.5μl；又用了一次Promega的T4，也是10μl体系，目的与载体的量不变，T4 0.5μl，buffer 1μl，仍然没连上！晕倒！

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]
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1楼2010-12-13 14:07:58
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郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一些，最后连接成功了。我用的是20μl体系（1μl T4 ligase，2μl buffer，剩余的17μl除了载体就是目的基因，你根据自己的浓度来定二者的比例，建议载体多加一些，毕竟浓度比较低）。祝实验顺利……
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2楼2010-12-15 15:57:15
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duanming123

木虫 (正式写手)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:42
用T4连么，6μl的基因，2μl载体，1μlbuffer, 1μl酶
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3楼2010-12-15 18:08:59
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-16 09:07:36
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:56
请问，你如何确定没有连接成功？经过PCR扩增验证了吗？建议每次转化之前，对连接体系进行质粒通用引物的PCR。
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4楼2010-12-16 09:03:45
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:59:16
这是大载体小片段的连接，不是很好连，可以试试低浓度的vecter高浓度的incert，最好都是新鲜制备的，连接体系的整体浓度大一点，连上应该还是没有问题的！
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5楼2010-12-16 11:04:52
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
感受态的转化效率才是最重要的。
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6楼2010-12-16 11:06:27
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pwj

银虫 (小有名气)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 12:30:33
用T4酶，7μl的目的片段，1μl载体片段，1μl10*buffer, 1μl酶
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7楼2010-12-16 13:35:35
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 12:30:38
浓度太低，建议重新获取载体和目的片段
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8楼2010-12-16 15:22:30
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 郝钊 at 2010-12-15 15:57:15:
从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一 ...

朋友怎么说要多加载体呢？我认为是不是应该多加一些目的片段呢？那样会增加与载体的碰撞几率吧？
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9楼2010-12-18 12:17:17
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by duanming123 at 2010-12-15 18:08:59:
用T4连么，6μl的基因，2μl载体，1μlbuffer, 1μl酶

这么多目的片段？
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10楼2010-12-18 12:19:21
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lulu1986 at 2010-12-16 09:03:45:
请问，你如何确定没有连接成功？经过PCR扩增验证了吗？建议每次转化之前，对连接体系进行质粒通用引物的PCR。

老兄，转化平板上就没菌落如何PCR？
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11楼2010-12-18 12:20:23
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by srlee at 2010-12-16 11:04:52:
这是大载体小片段的连接，不是很好连，可以试试低浓度的vecter高浓度的incert，最好都是新鲜制备的，连接体系的整体浓度大一点，连上应该还是没有问题的！

是吗？我原来一直觉得小片段大载体应该挺好连的，这次情况这么糟糕让我还自责是不是自己实验水平出问题了！另外请教老兄：新鲜回收的片段与放置一段时间的回收片段对连接有太大影响吗？为什么会有影响？请赐教！
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12楼2010-12-18 12:24:56
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-16 11:06:27:
感受态的转化效率才是最重要的。

感受态是买的商品化的，肯定没问题！
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13楼2010-12-18 12:28:23
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-12-16 15:22:30:
浓度太低，建议重新获取载体和目的片段

你的意思是多少的浓度比较合适呢？
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14楼2010-12-18 12:31:53
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:20:23:


老兄，转化平板上就没菌落如何PCR？

“连接体系”，兄台不知道是什么意思吗？我说的是“连接体系”，OK!
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15楼2010-12-18 12:32:12
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yrr032

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lulu1986 at 2010-12-18 12:32:12:

“连接体系”，兄台不知道是什么意思吗？我说的是“连接体系”，OK!

连接体系PCR？还真没这样做过，请指教！我觉得这样无论连没连上都应该可以P出目的片段吧？
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16楼2010-12-18 12:38:06
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郝钊

金虫 (小有名气)
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Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:17:17:


朋友怎么说要多加载体呢？我认为是不是应该多加一些目的片段呢？那样会增加与载体的碰撞几率吧？

你说的没错，浓度高了肯定碰撞的几率会增加，但是你的片段你不觉得浓度太低了嘛?稍微多加点载体，其余的加目的基因就可以了。
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17楼2010-12-18 21:03:01
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
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Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:24:56:


是吗？我原来一直觉得小片段大载体应该挺好连的，这次情况这么糟糕让我还自责是不是自己实验水平出问题了！另外请教老兄：新鲜回收的片段与放置一段时间的回收片段对连接有太大影响吗？为什么会有影响？请赐教！

就是以此包含有2.5μl目的片段，2μl 载体，4.5μl SolutionⅠ的10μl体系中的0.5μl为模板，以质粒上的通用引物或者目的片段的特定引物进行扩增，跑胶观察是否连接上。
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18楼2010-12-21 00:05:46
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
建议用1微升的载体，4微升的片段，5微升的solutionI就差不多了。。。
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19楼2010-12-21 10:46:05
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