[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验，在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利，但这次按照常规建立的体系，尝试了几次都没有连上，请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右，回收定量20ng/μl
载体大小6993bp，回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友，小弟不胜感激！（连接所用酶等均没有问题）

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ（该Mix是buffer和T4的混合物，2×），10μl的体系，目的用了2.5μl，载体用了2μl，SolutionⅠ4.5μl；又用了一次Promega的T4，也是10μl体系，目的与载体的量不变，T4 0.5μl，buffer 1μl，仍然没连上！晕倒！

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]

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1楼2010-12-13 14:07:58

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lulu1986

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引用回帖:

Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:24:56:

是吗？我原来一直觉得小片段大载体应该挺好连的，这次情况这么糟糕让我还自责是不是自己实验水平出问题了！另外请教老兄：新鲜回收的片段与放置一段时间的回收片段对连接有太大影响吗？为什么会有影响？请赐教！

就是以此包含有2.5μl目的片段，2μl 载体，4.5μl SolutionⅠ的10μl体系中的0.5μl为模板，以质粒上的通用引物或者目的片段的特定引物进行扩增，跑胶观察是否连接上。

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18楼2010-12-21 00:05:46

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郝钊

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rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18

从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一些，最后连接成功了。我用的是20μl体系（1μl T4 ligase，2μl buffer，剩余的17μl除了载体就是目的基因，你根据自己的浓度来定二者的比例，建议载体多加一些，毕竟浓度比较低）。祝实验顺利……

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2楼2010-12-15 15:57:15

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