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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】建个连接体系
汕头大学海洋科学接受调剂
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yrr032

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验，在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利，但这次按照常规建立的体系，尝试了几次都没有连上，请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右，回收定量20ng/μl
载体大小6993bp，回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友，小弟不胜感激！（连接所用酶等均没有问题）

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ（该Mix是buffer和T4的混合物，2×），10μl的体系，目的用了2.5μl，载体用了2μl，SolutionⅠ4.5μl；又用了一次Promega的T4，也是10μl体系，目的与载体的量不变，T4 0.5μl，buffer 1μl，仍然没连上！晕倒！

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]
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1楼 2010-12-13 14:07:58
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duanming123

木虫 (正式写手)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:42
用T4连么，6μl的基因，2μl载体，1μlbuffer, 1μl酶
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3楼2010-12-15 18:08:59
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郝钊

金虫 (小有名气)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一些，最后连接成功了。我用的是20μl体系（1μl T4 ligase，2μl buffer，剩余的17μl除了载体就是目的基因，你根据自己的浓度来定二者的比例，建议载体多加一些，毕竟浓度比较低）。祝实验顺利……
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2楼2010-12-15 15:57:15
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-16 09:07:36
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:56
请问，你如何确定没有连接成功？经过PCR扩增验证了吗？建议每次转化之前，对连接体系进行质粒通用引物的PCR。
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4楼2010-12-16 09:03:45
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:59:16
这是大载体小片段的连接，不是很好连，可以试试低浓度的vecter高浓度的incert，最好都是新鲜制备的，连接体系的整体浓度大一点，连上应该还是没有问题的！
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5楼2010-12-16 11:04:52
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