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汕头大学海洋科学接受调剂
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yrr032

新虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验,在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利,但这次按照常规建立的体系,尝试了几次都没有连上,请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右,回收定量20ng/μl
载体大小6993bp,回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友,小弟不胜感激!(连接所用酶等均没有问题)

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ(该Mix是buffer和T4的混合物,2×),10μl的体系,目的用了2.5μl,载体用了2μl,SolutionⅠ4.5μl;又用了一次Promega的T4,也是10μl体系,目的与载体的量不变,T4 0.5μl,buffer 1μl,仍然没连上!晕倒!

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]
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pwj

银虫 (小有名气)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 12:30:33
用T4酶,7μl的目的片段,1μl载体片段,1μl10*buffer, 1μl酶
7楼2010-12-16 13:35:35
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郝钊

金虫 (小有名气)


★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
从数据来看,你的载体浓度相对于目的基因来说比较低,加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接,比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的,前两次也是不行,第三次重新制备了一些载体,浓度提高了一些,最后连接成功了。我用的是20μl体系(1μl T4 ligase,2μl buffer,剩余的17μl除了载体就是目的基因,你根据自己的浓度来定二者的比例,建议载体多加一些,毕竟浓度比较低)。祝实验顺利……
2楼2010-12-15 15:57:15
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duanming123

木虫 (正式写手)


yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:42
用T4连么,6μl的基因,2μl载体,1μlbuffer, 1μl酶
3楼2010-12-15 18:08:59
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lulu1986

捐助贵宾 (小有名气)



dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-16 09:07:36
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:56
请问,你如何确定没有连接成功?经过PCR扩增验证了吗?建议每次转化之前,对连接体系进行质粒通用引物的PCR。
4楼2010-12-16 09:03:45
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