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[交流]
【求助/交流】建个连接体系
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本人最近在做连接实验，在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利，但这次按照常规建立的体系，尝试了几次都没有连上，请教虫友帮忙建个体系。 目的片段440bp左右，回收定量20ng/μl 载体大小6993bp，回收定量50ng/μl 真诚请教各位虫友，小弟不胜感激！（连接所用酶等均没有问题） 我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ（该Mix是buffer和T4的混合物，2×），10μl的体系，目的用了2.5μl，载体用了2μl，SolutionⅠ4.5μl；又用了一次Promega的T4，也是10μl体系，目的与载体的量不变，T4 0.5μl，buffer 1μl，仍然没连上！晕倒！ [ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ] |
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10楼2010-12-18 12:19:21
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rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18
| 从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一些，最后连接成功了。我用的是20μl体系（1μl T4 ligase，2μl buffer，剩余的17μl除了载体就是目的基因，你根据自己的浓度来定二者的比例，建议载体多加一些，毕竟浓度比较低）。祝实验顺利…… |
2楼2010-12-15 15:57:15
3楼2010-12-15 18:08:59
4楼2010-12-16 09:03:45
