24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yrr032

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 612.3
帖子: 100
在线: 209.9小时
虫号: 719961

[交流] 【求助/交流】建个连接体系

本人最近在做连接实验，在做此次连接之前的连接与酶切做的都很顺利，但这次按照常规建立的体系，尝试了几次都没有连上，请教虫友帮忙建个体系。
目的片段440bp左右，回收定量20ng/μl
载体大小6993bp，回收定量50ng/μl
真诚请教各位虫友，小弟不胜感激！（连接所用酶等均没有问题）

我开始没有用T4,用的是Takara的试剂盒里带的SolutionⅠ（该Mix是buffer和T4的混合物，2×），10μl的体系，目的用了2.5μl，载体用了2μl，SolutionⅠ4.5μl；又用了一次Promega的T4，也是10μl体系，目的与载体的量不变，T4 0.5μl，buffer 1μl，仍然没连上！晕倒！

[ Last edited by yrr032 on 2010-12-18 at 12:15 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有181人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

液相色谱仪挪了个位置，现在工作站与仪器之间无法建立连接？？已经有5人回复
用clontech的SMART建cDNA文库，连接转化不成功，求助！！急死了！！！已经有3人回复
连接体系的确定已经有19人回复
请问：SCLAE S=2，对于三维体系，意思是建一个2*2*2的超晶胞吗？已经有9人回复
【求助/交流】请问大家：将外源DNA与载体连接的体系怎么确定啊？已经有7人回复
【讨论】企业为什么要建立培训体系已经有3人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2010-12-13 14:07:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

郝钊

金虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 6 (幼儿园)
金币: 681
帖子: 175
在线: 38.8小时
虫号: 1003233

引用回帖:

Originally posted by yrr032 at 2010-12-18 12:17:17:

朋友怎么说要多加载体呢？我认为是不是应该多加一些目的片段呢？那样会增加与载体的碰撞几率吧？

你说的没错，浓度高了肯定碰撞的几率会增加，但是你的片段你不觉得浓度太低了嘛?稍微多加点载体，其余的加目的基因就可以了。

赞一下

回复此楼

17楼2010-12-18 21:03:01

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 19 个回答

郝钊

金虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 6 (幼儿园)
金币: 681
帖子: 175
在线: 38.8小时
虫号: 1003233

★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2010-12-15 17:25:06
yrr032(金币+1): 2010-12-18 11:58:18

从数据来看，你的载体浓度相对于目的基因来说比较低，加上你是用一个如此大的载体和如此小的目的基因进行连接，比较困难。我最近连接了一个7K加800bp的，前两次也是不行，第三次重新制备了一些载体，浓度提高了一些，最后连接成功了。我用的是20μl体系（1μl T4 ligase，2μl buffer，剩余的17μl除了载体就是目的基因，你根据自己的浓度来定二者的比例，建议载体多加一些，毕竟浓度比较低）。祝实验顺利……

赞一下(1人)

回复此楼

2楼2010-12-15 15:57:15

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖