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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药理学 » 【求助】关于神经元的western所遇到的问题
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huangwensh

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助】关于神经元的western所遇到的问题

各位，我是用新生大鼠海马神经元加药后提蛋白做western，但是做了6次始终不成功，三次是根本看不见荧光，还有两次是整张pvdf膜都发光，还有一次是膜的中间一片发光，其他地方不发光，是怎么回事呀、、？？是不是蛋白提的不好啊？？
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1楼 2010-11-30 20:24:43
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kno3

捐助贵宾 (著名写手)
★
huangwensh(金币+1): 2010-12-02 10:40:17
qinhy(金币+1):多谢指教，欢迎常来药学版！ 2010-12-03 21:39:07
先用现有的条件做下预实验呢？确定不是你自己操作的问题，或是东西没配好之类的问题。
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2楼2010-12-02 00:24:43
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2010-11-30 20:24:43:
各位，我是用新生大鼠海马神经元加药后提蛋白做western，但是做了6次始终不成功，三次是根本看不见荧光，还有两次是整张pvdf膜都发光，还有一次是膜的中间一片发光，其他地方不发光，是怎么回事呀、、？？是不是蛋 ...

请问发光的时候是什么感觉呢？
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3楼2011-01-10 08:59:38
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 08:59:38:



请问发光的时候是什么感觉呢？

加上ECL的时候在红光灯下就能看到光，关了关了红光灯，会很亮，但是很快就崔灭了也就5分钟吧，还有两次是关了灯以后光慢慢出现的，等了半分钟才有光，但是崔灭的时间也很短，很亮的光，
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4楼2011-01-10 11:08:17
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 11:08:17:


加上ECL的时候在红光灯下就能看到光，关了关了红光灯，会很亮，但是很快就崔灭了也就5分钟吧，还有两次是关了灯以后光慢慢出现的，等了半分钟才有光，但是崔灭的时间也很短，很亮的光，

好的，下次俺也观察一下，你现在做western一定很熟练了吧？

请问做了多少次才成功的呢？

现在我做的好苦恼啊
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5楼2011-01-10 20:40:37
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huangwensh

木虫 (著名写手)
★
qinhy(金币+1):鼓励回帖交流 2011-01-11 18:40:11
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-10 20:40:37:



好的，下次俺也观察一下，你现在做western一定很熟练了吧？

请问做了多少次才成功的呢？

现在我做的好苦恼啊

我是做的很熟练了，但是我只爆出过actin,样品从没成功过，不过你有什么问题，我可能有些可以帮你解答，呵呵，我也算是有经验的人吧，哈哈，你是一只没曝出来吗？膜用丽春红染上面有条带吗？
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6楼2011-01-11 10:15:35
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-11 10:15:35:


我是做的很熟练了，但是我只爆出过actin,样品从没成功过，不过你有什么问题，我可能有些可以帮你解答，呵呵，我也算是有经验的人吧，哈哈，你是一只没曝出来吗？膜用丽春红染上面有条带吗？

没有啊，一直很郁闷，丽春红染色没有条带，阳性对照也没有。想做抗体不同浓度的结果比较着看一下，但是觉得没有那么多的膜啊，真是麻烦的很啊
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7楼2011-01-12 00:17:30
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-12 00:17:30:



没有啊，一直很郁闷，丽春红染色没有条带，阳性对照也没有。想做抗体不同浓度的结果比较着看一下，但是觉得没有那么多的膜啊，真是麻烦的很啊

那你可以做一下点印记，就是剪一小块膜直接滴上你的蛋白再孵育一抗二抗再曝光看看，是不是你的蛋白根本就不表达。还有就是你曝完光的膜可以用一抗二抗洗脱液把抗体洗掉从新封闭孵育抗体再曝光。
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8楼2011-01-12 11:07:09
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pidou213

木虫 (正式写手)
★
qinhy(金币+1):鼓励继续回帖应助！ 2011-01-12 19:04:14
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 11:07:09:


那你可以做一下点印记，就是剪一小块膜直接滴上你的蛋白再孵育一抗二抗再曝光看看，是不是你的蛋白根本就不表达。还有就是你曝完光的膜可以用一抗二抗洗脱液把抗体洗掉从新封闭孵育抗体再曝光。

”剪一小块膜直接滴上你的蛋白再孵育一抗二抗“

这个地方不通过电转的方式的话，蛋白能挂在膜上吗？

会不会一洗就掉了
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9楼2011-01-12 11:17:28
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-12 11:17:28:



”剪一小块膜直接滴上你的蛋白再孵育一抗二抗“

这个地方不通过电转的方式的话，蛋白能挂在膜上吗？

会不会一洗就掉了

就是不会的，点上蛋白以后就封闭，然后按照western的方法继续做下去就行，
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10楼2011-01-12 13:07:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 13:07:41:


就是不会的，点上蛋白以后就封闭，然后按照western的方法继续做下去就行，

】

那样蛋白不会掉下来吗？
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11楼2011-01-12 22:46:16
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-12 22:46:16:

】

那样蛋白不会掉下来吗？

取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色

按这个方法试试，蛋白不会掉下来的，呵呵
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12楼2011-01-13 12:47:48
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-13 12:47:48:


取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗 ...

“按这个方法试试”不是成熟的方法吗？
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13楼2011-01-14 22:50:59
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pidou213 at 2011-01-14 22:50:59:


“按这个方法试试”不是成熟的方法吗？

我不知道，这是师姐告诉我的方法，可行的，
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14楼2011-01-15 13:20:52
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pidou213

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by huangwensh at 2011-01-15 13:20:52:


我不知道，这是师姐告诉我的方法，可行的，

好的，谢谢哦
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15楼2011-01-15 13:34:42
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1798011楼: Originally posted by huangwensh at 2011-01-10 11:08:17:
加上ECL的时候在红光灯下就能看到光，关了关了红光灯，会很亮，但是很快就崔灭了也就5分钟吧，还有两次是关了灯以后光慢慢出现的，等了半分钟才有光，但是崔灭的时间也很短，很亮的光，

我做western 也出现这种情况，最近新买了一个二抗，加上ECL后整张膜都很亮，但是它太亮了导致曝出的片子乌漆吗黑一片，根本看不见条带，而且淬灭时间很短，几分钟后再用灯照一下，根本没有荧光了。苦恼中，我现在猜想是不是二抗的浓度加太大了，你一般二抗用什么溶液配，浓度多大？
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16楼2012-03-24 11:18:05
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zrtpaopao

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1806092楼: Originally posted by huangwensh at 2011-01-12 11:07:09:
那你可以做一下点印记，就是剪一小块膜直接滴上你的蛋白再孵育一抗二抗再曝光看看，是不是你的蛋白根本就不表达。还有就是你曝完光的膜可以用一抗二抗洗脱液把抗体洗掉从新封闭孵育抗体再曝光。

想请教一下，膜可以重复利用，曝光完后你用的一抗二抗洗脱液具体指的是什么溶液？
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17楼2012-03-24 11:21:45
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
1959388楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-03-24 11:21:45:
想请教一下，膜可以重复利用，曝光完后你用的一抗二抗洗脱液具体指的是什么溶液？

呵呵,这个能买到现成的溶液，你可以咨询一下试剂公司，我已经毕业了，我们用的一抗二抗洗脱液是哪家的，我也记不清了，好像是碧云天的，但是洗脱过后的效果，可能不如前次曝光效果好，
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18楼2012-03-24 11:44:04
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
1959387楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-03-24 11:18:05:
我做western 也出现这种情况，最近新买了一个二抗，加上ECL后整张膜都很亮，但是它太亮了导致曝出的片子乌漆吗黑一片，根本看不见条带，而且淬灭时间很短，几分钟后再用灯照一下，根本没有荧光了。苦恼中，我现 ...

二抗是BSA， 1%的，我以前做的是原代，总是出现这种情况，直到毕业也没解决，后，来做别的细胞就没出现过这种情况，哎，
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19楼2012-03-24 11:46:20
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huangwensh

木虫 (著名写手)
引用回帖:
1959388楼: Originally posted by zrtpaopao at 2012-03-24 11:21:45:
想请教一下，膜可以重复利用，曝光完后你用的一抗二抗洗脱液具体指的是什么溶液？

不好意思啊，这个帖子发好久了，我以为你问我问题呢，一抗二抗洗脱液的成分，我不记得了，师兄师姐们也用过，结果都没有问题，后来，我得出结论，可能是我细胞的问题，呵呵
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20楼2012-03-24 11:48:00
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岩清郁

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
呵呵，说的好专业，近期学了，还算看得懂！
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21楼2012-03-24 21:06:36
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