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嘉笛

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】非特异性酶切

各位虫友,我现在在做以毕赤酵母为表达载体分泌表达Ek酶,表达出的Ek酶量比较少,所以需要进行超滤浓缩,然后对标签蛋白进行酶切。
    但是酶切后的电泳结果显示融合蛋白被切碎了,(切下的目的蛋白因分子量较小没有检测到,且目的蛋白没有活性),我们选择了23度和37度比较,结果也都是切碎了。
    这种情况可能是什么原因造成的呢?有没有可能是酵母发酵过程中的代谢产物?抑或酵母自身细胞破碎导致胞内有活性的杂蛋白释放出来?想了好久还是不知道问题出在哪里,实验很长时间了都进行不下去,很是着急,请各位虫友帮忙解答!谢谢
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
scelab(金币+2):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-05 23:50:28
嘉笛(金币+2): 2010-11-06 08:37:49
可能是酵母的蛋白酶混进去了,我们用的EK专一性很强的,没有你说的那个现象。
2楼2010-11-05 22:45:49
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嘉笛

木虫 (小有名气)


lxj341401  你好,请问你们做的也是毕赤酵母表达的Ek吗?用之前有没有纯化?我们的是SMD1168表达载体,诱导表达时采用0.5%甘油+1.0%甲醇共同补料,不知你们的发酵方案是怎样的啊?现在不知道问题出在哪里啊
3楼2010-11-06 08:42:41
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)


dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-06 09:36:05
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-11-06 08:42:41:
lxj341401  你好,请问你们做的也是毕赤酵母表达的Ek吗?用之前有没有纯化?我们的是SMD1168表达载体,诱导表达时采用0.5%甘油+1.0%甲醇共同补料,不知你们的发酵方案是怎样的啊?现在不知道问题出在哪里啊

我们不是用酵母,用大肠杆菌表达的,表达后要分离纯化的。
4楼2010-11-06 09:06:20
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