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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】非特异性酶切
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嘉笛

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】非特异性酶切

各位虫友，我现在在做以毕赤酵母为表达载体分泌表达Ek酶，表达出的Ek酶量比较少，所以需要进行超滤浓缩，然后对标签蛋白进行酶切。
    但是酶切后的电泳结果显示融合蛋白被切碎了，（切下的目的蛋白因分子量较小没有检测到，且目的蛋白没有活性），我们选择了23度和37度比较，结果也都是切碎了。
    这种情况可能是什么原因造成的呢？有没有可能是酵母发酵过程中的代谢产物？抑或酵母自身细胞破碎导致胞内有活性的杂蛋白释放出来？想了好久还是不知道问题出在哪里，实验很长时间了都进行不下去，很是着急，请各位虫友帮忙解答！谢谢
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1楼 2010-11-05 21:00:37
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-11-05 23:50:28
嘉笛(金币+2): 2010-11-06 08:37:49
可能是酵母的蛋白酶混进去了，我们用的EK专一性很强的，没有你说的那个现象。
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2楼2010-11-05 22:45:49
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嘉笛

木虫 (小有名气)
lxj341401  你好，请问你们做的也是毕赤酵母表达的Ek吗？用之前有没有纯化？我们的是SMD1168表达载体，诱导表达时采用0.5%甘油+1.0%甲醇共同补料，不知你们的发酵方案是怎样的啊？现在不知道问题出在哪里啊
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3楼2010-11-06 08:42:41
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-06 09:36:05
引用回帖:
Originally posted by 嘉笛 at 2010-11-06 08:42:41:
lxj341401  你好，请问你们做的也是毕赤酵母表达的Ek吗？用之前有没有纯化？我们的是SMD1168表达载体，诱导表达时采用0.5%甘油+1.0%甲醇共同补料，不知你们的发酵方案是怎样的啊？现在不知道问题出在哪里啊

我们不是用酵母，用大肠杆菌表达的，表达后要分离纯化的。
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4楼2010-11-06 09:06:20
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