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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于引物退火温度
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weiminhb

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于引物退火温度

之前设计的引物能扩增出条带，后来加入了酶切位点，新的引物最佳退火温度会不会变化？
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1楼 2010-11-01 14:04:39
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
应该不会
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2楼2010-11-01 14:21:09
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linqin1029

新虫 (初入文坛)
可以不用变！
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3楼2010-11-01 14:45:34
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-11-01 14:21:09:
应该不会

还是决定先做一下梯度PCR，确定一下
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4楼2010-11-01 15:13:13
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪
引入几个酶切位点，才改变几个碱基，退火温度一般是不会改变滴
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青春的岁月，我们身不由己，只因这胸中燃烧的梦想！
5楼2010-11-01 15:15:16
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fzfangtao

木虫 (正式写手)
不会变多少的
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6楼2010-11-01 16:42:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-01 18:52:27
我的看法跟以上的都不一样
退火温度怎么可能不变呢？改变一个碱基都会变，酶切位点，至少都4~6个碱基了吧，然后还有保护剪辑再多2~4个，温度至少可以变5度了

我的建议是，在前面8~10轮循环用原引物的退火做PCR，后面的十几二十个用全长引物的退火来做。这样做出来的PCR，特异性高，效率也高。
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7楼2010-11-01 16:59:33
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-01 16:59:33:
我的看法跟以上的都不一样
退火温度怎么可能不变呢？改变一个碱基都会变，酶切位点，至少都4~6个碱基了吧，然后还有保护剪辑再多2~4个，温度至少可以变5度了

我的建议是，在前面8~10轮循环用原引物的退火做PC ...

这是最好的办法。如果片段小的话，就不用这么麻烦了。
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8楼2010-11-01 17:21:34
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-11-01 17:21:34:


这是最好的办法。如果片段小的话，就不用这么麻烦了。

其实一点都不麻烦，不都是机器完成的活儿么~~要是换做以前用水浴锅做PCR，咔咔
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9楼2010-11-01 17:26:31
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-01 16:59:33:
我的看法跟以上的都不一样
退火温度怎么可能不变呢？改变一个碱基都会变，酶切位点，至少都4~6个碱基了吧，然后还有保护剪辑再多2~4个，温度至少可以变5度了

我的建议是，在前面8~10轮循环用原引物的退火做PC ...

感谢交流！你是说前8-10个循环用原引物退火温度PCR，后面的用新引物的退火温度PCR，是吗？那新引物的退火温度怎么确定啊？谢谢
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10楼2010-11-02 09:27:12
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