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weiminhb

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于引物退火温度

之前设计的引物能扩增出条带,后来加入了酶切位点,新的引物最佳退火温度会不会变化?
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-11-01 18:52:27
我的看法跟以上的都不一样
退火温度怎么可能不变呢?改变一个碱基都会变,酶切位点,至少都4~6个碱基了吧,然后还有保护剪辑再多2~4个,温度至少可以变5度了

我的建议是,在前面8~10轮循环用原引物的退火做PCR,后面的十几二十个用全长引物的退火来做。这样做出来的PCR,特异性高,效率也高。
7楼2010-11-01 16:59:33
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weiminhb

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 虫子火箭兵 at 2010-11-01 14:21:09:
应该不会

还是决定先做一下梯度PCR,确定一下
4楼2010-11-01 15:13:13
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)

大洪

引入几个酶切位点,才改变几个碱基,退火温度一般是不会改变滴
青春的岁月,我们身不由己,只因这胸中燃烧的梦想!
5楼2010-11-01 15:15:16
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-01 16:59:33:
我的看法跟以上的都不一样
退火温度怎么可能不变呢?改变一个碱基都会变,酶切位点,至少都4~6个碱基了吧,然后还有保护剪辑再多2~4个,温度至少可以变5度了

我的建议是,在前面8~10轮循环用原引物的退火做PC ...

这是最好的办法。如果片段小的话,就不用这么麻烦了。
8楼2010-11-01 17:21:34
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