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pumpkin236铁虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】关于MTT的一些疑惑
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最近重复做了两次MTT加药实验，效果都不好。有几点疑问想请教一下 1由于酶标仪坏了，用的是24孔板，用紫外分光光度计测得。细胞总是接种不均匀，不知道大家接种的密度怎么把握？我是先加少量的细胞悬液于孔板中，然后补加完全培养基至1毫升。但是第二天还是发现长的不均匀，有些地方很稀，有些又快接触抑制了，不知道有什么好方法可以让长的均匀些 2对于血清的影响有点疑惑。实验室传统做法是，前一天接种，第二天早上换无血清培养基，说什么同步化，（同步化是虾米意思），12小时后含药物的无血清培养基，然后24小时后做MTT。由于我的细胞是2nih3t3，用无血清培养基培养后很快萎靡了，然后死了。所以在上述步骤中换成了5%血清的培养基。但是又有师姐说血清对实验结果影响很大。我很纳闷，因为家DMSO之前，含血清的培养基已经吸走后才加的DMSO溶解，残留不多，应该影响不大啊。求教啊 3还有就是关于染菌问题。上次做过一次，发现以前没有发现的问题，加MTT前发现有漂浮物，而且貌似有很多细胞已经不是以前的形状，貌似是萎靡或死了。加MTT死小时后，漂浮物竟然染色了，有紫色的晶体。我一直以为漂浮物是死细胞，难道是细菌么？ 问题有点多，希望哪位有经验的好心人细心解答下。。。。 |
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2楼2010-10-29 22:48:59
lxyyzz
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3楼2010-10-30 08:50:45
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4楼2012-09-24 16:37:00
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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我经常做MTT，分享一下经验哈。 我都是用96孔板做的，接板之前，细胞先制成悬液，用原培养基，是有血清的。每孔接种量是4000-8000个，也就相当于平时传代时传一瓶的量，比如平时1传3，就用消化下的一瓶细胞的1/3接一块板。接板前，细胞悬液一定要吹打均匀，可以多次吹打，接板时，横着接，每孔接100ul细胞悬液，每接10个孔吹打一次细胞悬液，也就是说不同实验组的各接一孔后吹一次，这样就可以保证不同处理的细胞量是一样的。 一般接板24小时后就可以加药了，药物也是用相同的培养基配制的。对照组换无药的相同培养基。48小时候做MTT，MTT可以事先配成5倍的储液，就不用吸出每孔的培养基再加MTT了。加完后37度再作用4小时，吸出每孔的液体，加100ulDMSO溶解甲瓒结晶，再测OD值。一般做出来的结果平行对照的数值差异不会大于0.1，有时候小数点后第二位差异也很小，数据很整齐的。 如果是24孔板，也建议先制成细胞悬液，接种后在超净台上放置10分钟左右再拿出来，这样细胞差不多沉下去了，就不会分布不均匀了。或者在接板之前，用PBS把板先湿润一下，效果会好点。 自己的一点经验，交流一下~ |
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tianhui7255楼2012-12-20 15:18:41
6楼2013-01-16 22:44:03