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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 【求助/交流】同尾酶构建载体问题
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】同尾酶构建载体问题 已有1人参与

大家好！
       我最近做重组载体的构建，载体3.5kb，目的片段2.5kb，就是将PCR产物和载体同时BglII和BamHI双酶切（问题是设计引物的时候忽略了这两个酶是同尾酶，两端加了3-4个保护碱基），按常规酶切，连接，转化JM109后，两次都未长菌，一颗都没有？连载体自连都没有嘛？
     请问同尾酶连接需要注意什么？容易成功不？请大家多提建议哈，谢谢！
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1楼 2010-10-22 10:49:58
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若雪敏敏

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同尾酶切载体，酶切后想筛选载体自连的质粒，怎么处理机率更高尼？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-03-02 21:56:31
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
可能是转化出了问题。
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2楼2010-10-22 10:53:15
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-10-22 10:53:15:
可能是转化出了问题。

谢谢，你是说感受态不好，还是操作？实验室公用的感受态，我也没检查过感受性，今天测试下。
请问同尾酶连接时需要注意哪些啊？
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3楼2010-10-22 11:06:24
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
★
04swlcm(金币+1):谢谢参与
04swlcm(金币+1): 2011-01-14 20:59:55
同尾酶应该有很好的连接效果，不过片段不要加的太多了以免片段自连，还有载体自连也应该是很多，我估计是你酶切上出了问题，没有切好。
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5楼2010-10-22 17:20:15
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