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2140061

铜虫 (小有名气)

[求助] pet30a怎么构建C端His-tagged的载体啊？

pet30a载体在MCS两端都有His-tagged，怎么构建讲目的蛋白只在C端His-tagged的载体啊？
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1楼 2011-10-20 18:46:01
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

2140061(金币+8): 谢谢你的回复，请问如果C端没终止子密码子，是不是就是两端都有His-tagged？ 2011-10-21 22:37:19
双酶切做连接时5‘端选用Nde I酶切位点，这样N端的His-taq就能切掉。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-10-21 08:51:48
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sl35537417

木虫 (正式写手)
楼上正解
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3楼2011-10-21 08:58:12
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

然后3’端设计引物时记得将基因的终止密码子突变掉。
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Thank-you，so-blue.
4楼2011-10-21 09:16:28
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2140061

铜虫 (小有名气)
谢谢楼上回复，请问如果C端没终止子密码子，是不是就是两端都有His-tagged？
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5楼2011-10-21 22:38:02
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！等待楼主回复后，给与专家指数！ 2011-10-22 10:04:52
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): 根据 2011-10-22 23:50:44
wanhscn: 根据楼主反馈,给与专家指数!Good! 2011-10-22 23:51:22
引用回帖:
5楼: Originally posted by 2140061 at 2011-10-21 22:38:02:
谢谢楼上回复，请问如果C端没终止子密码子，是不是就是两端都有His-tagged？

不是的，你不是只需要C端由his-taq吗？那么连接的时候，上游引物引物引入Nde I酶切位点，这样就可以切掉N端的his-taq。然后下游引物设计的时候需要突变掉终止密码子，这样C端才能保留his-taq，不然基因表达到his-taq之前就终止了。
我觉得你需要把PET30a质粒的物理图谱好好看看。应该可以看懂的。
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Thank-you，so-blue.
6楼2011-10-22 09:59:53
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loganfan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

选择正确的酶切位点就可以了，使自己的目的基因插入质粒后，后面紧随6个HIS
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7楼2011-10-22 18:51:38
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2140061

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by susizheng at 2011-10-22 09:59:53:
不是的，你不是只需要C端由his-taq吗？那么连接的时候，上游引物引物引入Nde I酶切位点，这样就可以切掉N端的his-taq。然后下游引物设计的时候需要突变掉终止密码子，这样C端才能保留his-taq，不然基因表达到his ...

我看懂了,如果我想做C端的his-tagged的话,怎么构建我已经看懂了。
我的另外一个问题是，如果N端，我不用Nde I酶切掉，而且C端我也不加终止密码子，是不是就是N、C端都带有His-tagged？谢谢哈
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8楼2011-10-22 21:55:50
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
引用回帖:
楼: Originally posted by 2140061 at 2011-10-22 21:55:50:
我看懂了,如果我想做C端的his-tagged的话,怎么构建我已经看懂了。
我的另外一个问题是，如果N端，我不用Nde I酶切掉，而且C端我也不加终止密码子，是不是就是N、C端都带有His-tagged？谢谢哈

是的

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Thank-you，so-blue.
9楼2011-10-22 23:28:22
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