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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】镍柱纯化的蛋白保存在-20度一个星期，拿出来都是沉淀？？
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三妹妹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】镍柱纯化的蛋白保存在-20度一个星期，拿出来都是沉淀？？ 已有12人参与

当初纯化完后还很清亮的，未加甘油，放在-20度，放假回来管里都是白色沉淀（蛋白吧），不知道原因？用尿素1：1可以溶解。
尿素溶解后蛋白的活性会受到影响吗？
期待达人帮忙解答一下吧，万分感谢！
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1楼 2010-10-11 11:27:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-11 17:02:30
其实甘油是可以不加的，试试下述条件：

分装小份，30ul于PCR薄壁管中；

液氮速冻，保存于-80；

取出来后，握于手中解冻。

呵呵，一篇文献上这样写的，说可以有效防止蛋白沉淀。挺好用的。

祝好运
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2010-10-11 13:25:19
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playboy723

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
再做western时有这么个现象：抗体溶于脱脂奶粉后冻于冰箱后取出会出现沉淀，结果在室温融化后孵育膜1小时后发现液体中的沉淀消失了，好像提高到一定温度后震荡几次沉淀会自然消失，但不知影不影响蛋白活性，你可以这样试试
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10楼2010-10-12 12:04:29
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jingcp200320

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by jingcp200320 at 2010-10-12 16:10:04:
如果你NI柱纯化完成后没有透析，可能析出的是咪唑等盐类，我透析好之后放在4度基本没有问题！

建议你重新纯化新的裂解蛋白液吧，反复折腾蛋白肯定不好了，你纯化好之后，马上透析过夜，然后保存肯定没有问题。
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15楼2010-10-14 09:40:41
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普通回帖

王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2):鼓励热心虫友交流。 2010-10-11 12:11:34
那要看你加的尿素浓度啊，8M的肯定没活性了，低浓度的一般没影响（1-2M），我就常用1M的尿素溶解蛋白，活性没有影响啊。你说的1：1没有提到浓度多大啊，所以很难说。
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2楼2010-10-11 11:55:32
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
三妹妹(金币+2):谢谢那！！ 2010-10-11 13:15:12
至于蛋白沉淀，时间长了别说是-20，就算-80也会沉淀变性啊，再说你也没加保护剂啊。
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3楼2010-10-11 11:57:07
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三妹妹

金虫 (小有名气)
呀呀，不好，我加了8M的尿素，
还好没有全加，剩下的用1M的试试。
沉淀物就是变性了的蛋白吗？
那保护剂一般加什么，除了甘油还有别的吗？
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4楼2010-10-11 13:13:35
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):很热心，很活跃，鼓励。 2010-10-11 17:02:45
如果想尽可能大的保留蛋白活性的话不赞成速冻，可以将蛋白吸入移液枪中，空的EP管浸入液氮，一滴滴的打到EP管中，少量多份保存。
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6楼2010-10-11 14:09:19
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
保护剂很多啊，DTT，Triton，OB-2等都可以。甘油较常用。
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7楼2010-10-11 14:10:26
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三妹妹

金虫 (小有名气)
dhd997:建议：可以引用回复。 2010-10-11 17:03:15
嗯，学习了，谢谢各位！
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8楼2010-10-11 14:49:06
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这种沉淀现象太常见了
我一般都是直接扔了，不冒这个风险。
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9楼2010-10-11 19:30:47
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