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liubin专家顾问 (著名写手)
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[交流]
【交流】SDS-PAGE
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本人以前未做过SDS-PAGE ，操作中遇到很多问题，至今未解决。 我将实验中遇到的问题，按时间顺序汇报如下，请大家不吝赐教。情况如下： 我使用的是凯基生物的全套试剂盒，使用的电泳槽为：BIO-RAD MINI-PROTEAN... 1. 按说明书配制分离胶和浓缩胶，及其他试剂。 分离胶凝胶时间2h 电流：10MA/30MA. 电泳时间：10h 结果：样品几乎一直停留在点样点一下2cm处。 2。 将4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8 稀释4倍使用 分离胶凝胶时间2h，剩余胶不凝，胶版内胶似乎已经凝固，故继续后续过程。 电流：10MA/50MA. 电泳时间：4h 结果：样品几乎一直停留在点样点一下2cm处。 检查发现，上槽漏液，但液面停留在梳齿一下位置左右，原因：上槽短玻璃板处未卡紧。 处理好漏液后继续电泳，电流：10MA，30min，跑胶完成，染色后有条带 3。 重复以上步骤，电流：10/15/30MA，9h，染色后有条带。 我认为，上述实验均失败，请大家帮忙找一下原因。具体请教一下问题： 1） 是否要同时设定电流和电压？国外的资料是以功率w 来表示的。 2） 4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8 是否要进行稀释？ 3）我使用的电泳仪是否有问题？ 等候赐教！ 万分感谢！ |
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dj04164
木虫 (正式写手)
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winter_gates
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liubin(金币+1): 2010-09-19 14:44:35
americanyk(金币+1):谢谢回帖交流 2010-09-19 09:40:00
liubin(金币+1): 2010-09-19 14:44:35
americanyk(金币+1):谢谢回帖交流 2010-09-19 09:40:00
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要看你是什么样品，样品在缓冲液下是否有电离，如果是SDS-PAGE的话一般样品是蛋白质且表面的电荷是SDS给予的，我做蛋白样品的时候，一般是设置电压，积层胶一般50V20-25min，分离胶一般120V-180V，40min-1.5h。下面是我常用的buffer Tris-tricine电泳缓冲液： Cathode buffer 负极缓冲液：pH 8.25（可不调pH） Tris-Hcl 100 mM tricine 100 mM SDS 0.1% 500 ml：6.055g Tris + 8.96g Tricine + 0.5g SDS Anode buffer 正极缓冲液：pH8.9 Tris-Hcl 200 mM 1000 ml：24.22g Tris 额，写到这，我知道你的问题了，电泳液…… |
3楼2010-09-19 11:21:41
