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liubin

专家顾问 (著名写手)

[交流] 【交流】SDS-PAGE

本人以前未做过SDS-PAGE ，操作中遇到很多问题，至今未解决。
我将实验中遇到的问题，按时间顺序汇报如下，请大家不吝赐教。情况如下：

  我使用的是凯基生物的全套试剂盒，使用的电泳槽为：BIO-RAD MINI-PROTEAN...
1. 按说明书配制分离胶和浓缩胶，及其他试剂。
分离胶凝胶时间2h
电流：10MA/30MA. 电泳时间：10h
结果：样品几乎一直停留在点样点一下2cm处。
2。 将4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8 稀释4倍使用
分离胶凝胶时间2h，剩余胶不凝，胶版内胶似乎已经凝固，故继续后续过程。
电流：10MA/50MA. 电泳时间：4h
结果：样品几乎一直停留在点样点一下2cm处。

检查发现，上槽漏液，但液面停留在梳齿一下位置左右，原因：上槽短玻璃板处未卡紧。
处理好漏液后继续电泳，电流：10MA，30min，跑胶完成，染色后有条带
3。 重复以上步骤，电流：10/15/30MA，9h，染色后有条带。


我认为，上述实验均失败，请大家帮忙找一下原因。具体请教一下问题：
1） 是否要同时设定电流和电压？国外的资料是以功率w 来表示的。
2） 4×Tris-HCl/SDS, pH8.8 及4×Tris-HCl/SDS, pH6.8  是否要进行稀释？
3）我使用的电泳仪是否有问题？

等候赐教！
万分感谢！
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1楼 2010-09-19 11:03:03
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
★
liubin(金币+1): 2010-09-19 14:44:26
yusen_1982(金币+1):欢迎讨论 2010-09-20 21:46:56
1一般只设功率，
2 检查电泳仪有问题的话，可以让同学用其他样试一下，一般不会是电泳仪的问题。
我建议你把胶的浓度降低试一下。你的样可能片段太大。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-09-19 11:17:11
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
★
liubin(金币+1): 2010-09-19 14:44:35
americanyk(金币+1):谢谢回帖交流 2010-09-19 09:40:00
要看你是什么样品，样品在缓冲液下是否有电离，如果是SDS-PAGE的话一般样品是蛋白质且表面的电荷是SDS给予的，我做蛋白样品的时候，一般是设置电压，积层胶一般50V20-25min，分离胶一般120V-180V，40min-1.5h。下面是我常用的buffer

Tris-tricine电泳缓冲液：
Cathode buffer 负极缓冲液：pH 8.25（可不调pH）
Tris-Hcl     100 mM
tricine       100 mM
SDS        0.1%
500 ml：6.055g Tris + 8.96g Tricine + 0.5g SDS

Anode buffer 正极缓冲液：pH8.9
Tris-Hcl     200 mM
1000 ml：24.22g Tris


额，写到这，我知道你的问题了，电泳液……
赞一下(1人) 回复此楼
For my life！
3楼2010-09-19 11:21:41
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dj04164

木虫 (正式写手)
★
liubin(金币+1): 2010-09-20 09:49:54
yusen_1982(金币+1):欢迎讨论 2010-09-20 21:47:06
加个marker看看吧。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-09-19 20:58:28
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